实时定量PCR技术与应用指南.pptVIP

定量PCR原理、应用及数据分析;原理：;起点定量与终点定量：

起点的DNA量为“天然”的含量，更有意义；终点的DNA量为经过PCR过程“加工”的量，存在部分“失真”。（终点定量存在更大的误差）

;定量PCR：通过实时监测PCR每一种循环扩增产物相相应的荧光信号，来实现对起始模板进行定量或者定性的分析

化学原理：荧光染料嵌合法,探针法;探针法：可用于多重PCR及基因分型

TaqMan探针：检测积累荧光

一种寡核苷酸探针,探针两端各锚定一种基团，淬灭剂则在3‘末端。

;基线：扩增曲线中的水平部分

阈值（Threshold):指扩增曲线的指数增长区域内合适位置上设定的荧光检测界限。

Ct值：从基数到指数增长的拐点所相应的循环次数;定量PCR数学原理;定量PCR技术的应用;定量PCR试验流程;定量PCR引物设计的要求：

①Tm=55-65℃

②GC=30-80%

③PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，普通在80-300bp之间都可。

④引物的退火温度要高，普通要在60℃以上。;第11页;;内参基因的选择：

内参：用于去除不同样本在RNA的产量、质量以及逆转录效率差别对目标基因表示的影响。

稳定表示于不同类型的组织和细胞中（如正常细胞和癌细胞），而且其表示量无显著差别；

高度或中度表示，排除太高或太低表示；

表示水平与细胞周期、