实时荧光定量PCR_技术的原理及其应用研究进展.pdf

维普资讯 第 16卷第 4期 中 国组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志 V01．16．No．4 2007年8月 CHINESEJOURNALOFHISTOCHEMISTRYANDCYTOCHEM ISFRY Aug．2007 实时荧光定量 PCR技术的原理及其应用研究进展 赵焕英 包金风 (首都医科大学北京神经科学研究所，北京市神经再生修复重点实验室，教育部神经变性病重点实验室，北京 100069) 【关键词】 实时荧光定量PCR； 荧光标记探针 ； DNA结合染料 [中图分类号) Q523．1 [文献标识码) A 自从 1983年 Mullis发明聚合酶链式反应 lOnm)，报告基 团发出的荧光能被淬灭基团所吸 (polymerasechainreaction，PCR)以来 ，PCR技术 收，并依赖其较高的S／N 比值 (信．噪比，signa1． 很快成为科研、临床诊断的热点技术。但是传统 to-noiseratio)和 良好的辨别能力进行定量检测。 PCR技术在应用中一是不能准确定量，二是容易 1．2实时荧光定量 PCR几个重要参数 交叉污染，产生假阳性。直到近年来荧光共振能量 ①荧光域值 (threshold)：以PCR反应的前15 转 移 (fluorescence resonanceenergy transfer ， 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域 FRET)技术用于PCR定量后，上述问题才得到较 值定义为3—15个循环的荧光信号的标准偏差的 好的解决…。实时荧光定量PCR (real-timefluom- 10倍。②Ct值：也称循环 阈值，C代表 Cycle，t geneticqunatitativePCR，FQ-PCR)是在PCR定性 代表threshold。Ct值是指样品管的荧光信号达到 技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在 某一固定阈值的PCR反应循环数。在 PCR循环过 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积 程中，即荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的 累实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对 拐点所对应的循环次数。在实际操作中，这个时刻 未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了 也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的 对 DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性 时刻，可见Ct值取决于阈值。③ARn：是指模板 和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、 DNA的起始拷贝数 (图1所示)。经数学证明，Ct 无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛 值与模板DNA的起始拷贝数 (ARn)成反 比。典 应用于分子生物学研究和医学研究等领域 J。 型的PCR分4给阶段 (图2)。 1．实时荧光定量PCR技术的概述 1．1荧光共振能量转移原理 1992年 Higuchi等首次提出了采用动态 PCR 方法和封闭式检测方式对 目的核酸数量进行定量分 析，荧光探针技术是基于标记基团的FRET原理而 实现的，当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基 团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能 图1 实时荧光定量PCR几个重要参数 量可以从短波长 (高能量)的荧光基团传递到长波 Fig．1 TheimportantparametersofrealtimePCR 长 (低能量)的荧光基团，相当于短波长荧光基团 释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FERT。在探针 5’端标记一个报告基团 (R)，在3’端标记一个 淬灭基 团 (quencher，Q)，两者距离很近时 (7- [收稿 日期]2006．10-31 [修回日期]2007-01-26 [作者简介]赵焕英，女 (1975)，汉族 ，在读硕士研究生。 图2 典型的PCR分4个阶段 十通讯作者(Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed) Fig．2 Th e4ph