维生素D测定法.pdfVIP

附录 VII K 维生素 D 测定法 本法系用高效液相色谱法(附录V D)测定维生素D(包括维生素D 和D ，下 2 3 同)及其制剂、维生素AD 制剂或鱼肝油中所含维生素D 及前维生素D 经折算成 维生素D 的总量，以单位表示，每单位相当于维生素D 0.025 μg 。 测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行。 无维生素A 醇及其他杂质干扰的供试品可用第一法测定，否则应按第二法 处理后测定；如果按第二法处理后，前维生素D 峰仍受杂质干扰，仅有维生素D 峰可以分离时，则可按第三法测定。 第一法 对照品贮备溶液的制备 根据各制剂中所含维生素D 的成分,精密称取相应 的维生素D2 或D3 对照品25mg,置100ml 棕色量瓶中，加异辛烷80ml，避免加热， 用超声处理助溶1 分钟使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀，作为贮备溶液（1）； 精密量取5.0ml 至50mL 棕色量瓶中，加异辛烷稀释至刻度，摇匀，充氮密塞， 避光，0℃以下保存，作为贮备溶液（2 ）。 测定维生素D2 时，应另取维生素D3 对照品25mg ，同法制成维生素D3 对照 品贮备溶液，供系统适用性试验用。 色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂，正己烷-正戊醇(997:3)为流 动相，检测波长为254nm 。量取维生素D3 对照品贮备溶液（1）5ml，置具塞玻 璃容器中，通氮后密塞，置 90℃水浴中加热 1 小时，取出迅速冷却，加正己烷 5ml，摇匀，置1cm 具塞石英吸收池中，在2 支8W 主波长分别为254nm 和365nm 的紫外光灯下，将石英吸收池斜放成45 °,并距灯管5～6cm,照射5 分钟,使溶液 中含有前维生素D3 、反式维生素D3 、维生素D3 和速甾醇D3 ；取此溶液注入 液相色谱仪，测定维生素D3 的峰值，先后进样5 次,相对标准偏差应不大于2.0 ％；前维生素D3(与维生素D3 的比保留时间约为0.5)与反式维生素D3(与维生 素D3 的比保留时间约为 0.6) 以及维生素D3 与速甾醇D3(与维生素D3 的比保留 时间约为1.1)的峰分离度均应大于1.0。 1 校正因子测定 精密量取对照品贮备溶液（2 ）5ml，置 50ml 量瓶中，加正 己烷至刻度，摇匀，作为对照品溶液；取一定量注入液相色谱仪，计算维生素D 的响应因子f 。 1 f ＝C /A 1 1 1 式中：C1 为维生素D 对照品溶液的浓度（µg/mL ） A1 为对照品溶液所得色谱图中维生素D 峰的峰面积 另精密量取对照品贮备溶液5ml 置50ml 量瓶中，加入2 ，6-二叔丁基对甲 酚结晶1 粒，通氮排除空气后，密塞，置90℃水浴中加热1．5 小时，取出迅 速冷却至室温，加正己烷至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液；取一定量注入液 相色谱仪，计算前维生素D 的响应因子f 。 2 f ＝(C －f A ) ／A 2 1 1 1 2 式中 C1 为f1 测定项下维生素D 对照品溶液的浓度（µg/mL ） f1 为维生素D 的校正因子； A1 为混合对照品溶液所得色谱图中维生素D 的峰值； A2 为混合对照品溶液所得色谱图中前维生素D 的峰值。 含量测定 取该制剂项下制备的供试品溶液进行测定,按下列公式计算维生 素D 及前维生素D 折算成维生素D 后的总浓度 (Ci) 。 Ci ＝f A ＋f A 1 i1 2 i2 式中 Ai1 为维生素D 的峰值； Ai2 为前维生素D 的峰值； 第二法 精密称取供试品适量(相当于维生素D 总量600 单位以上，重量不超过2.0g) ， 置皂化瓶中，加乙醇3