第5章目的基因导入受体细胞1.ppt

第五章 目的基因导入受体细胞;受体细胞选择的基本原则;2. 原核生物受体细胞;2）主要的原核受体细胞 * 大肠杆菌 * 枯草杆菌 * 蓝细菌 3）应用 * 构建基因组文库 * 表达基因产物 * 保存和扩增目的基因;3. 酵母受体细胞;4. 植物受体细胞;5. 动物受体细胞;第二节 重组DNA导入原核受体细胞;1.转化（Transformation）;1）菌体培养：;2）制备感受态细胞;3）重组DNA转化受体细胞;转化处理;4）筛选转化子;转化过程总结示意图;* 50 ng重组DNA（10kb）转化JM101后共获得105 个阳性克隆子,计算其转化率 (1bp = 660 Da).;2.转导(Transduction);1）制备包装提取物;含噬菌体尾部蛋白(BHB2688)的制备 (E蛋白缺失);2） 体外包装;3）重组DNA导入受体细胞;3.三亲本杂交(Triparental mating);三亲本杂交的一般过程;第三节 重组DNA导入植物细胞;农杆菌Ti质粒转化过程;1）叶盘法转化植物受体细胞;2）原生质体共培养法;2.重组DNA直接转化法 通过物理或化学方法将外源基因转入受体细胞; 2）基因枪法 利用被放电或机械加速的金属微粒轰击受体细胞，使吸附在金属微粒表面的重组DNA一起进入受体细胞。 3）激光微束穿孔法 利用激光微束击穿细胞壁和细胞膜，引起细胞可逆性穿孔，使重组DNA进入受体细胞内。;4）显微注射法通过微量注射器将重组DNA直接注入受体细胞中;5）脂质体介导法 将重组DNA包裹在人工构建的磷脂双分子层脂质体中，通过原生质体与脂质体的融合或原生质体的吞噬作用而将 DNA转移到细胞内。;6）多聚物介导法：利用聚乙二醇（PEG）等与 二价阳离子（Ca2+，Mg 2+ ，Mn 2+等）及重 组DNA混合，沉淀在受体细胞原生质的表面， 通过原生质体的内吞噬作用，将DNA吸入受 体细胞内。 7）花粉管通道法：将外源DNA涂于受粉的柱头 上，使DNA 沿花粉管通道或传递组织通过珠 心进入胚囊，转化不具细胞壁的合子，及早 期的胚细胞;第四节 重组DNA导入动物受体细胞;2。转染法;3。显微注射法 以微量注射器直接将重组DNA注入受体细胞内;4。电穿孔法 利用高压脉冲电场处理动物受体细胞，使细胞膜和核膜部分缺失，外源重组DNA进入细胞核，与染色体DNA整合。 5。脂质体介导法：;第五节 重组子的筛选;1.遗传表型直接筛选法;B.插入失活筛选法;C.插入表达筛选法：利用外源目的基因插入克隆载体后激活筛选标记基因的表达。一般是在筛选标记基因前设计一段负调控序列，外源基因插入到负调控序列并使之失活。;D.显色互补反应筛选法;E。报告基因筛选法：在植物转基因中常在载体中加入选择标记基因（报告基因），在没有选择压力的情况下，报告基因能正常表达，从而从大量的非转化克隆子中筛选出含有目的基因的克隆子。常用的报告基因有抗生素抗性基因、酶蛋白基因等。 新霉素磷酸转移酶基因 潮霉素磷酸转移酶基因 氯霉素乙酰转移酶基因 荧光素酶基因;F.遗传选择标记筛选法：在动物转基因中利用胸腺核苷激酶基因（tk)、二氢叶酸还原酶基因（dhfr)、新霉素磷酸转移酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因等作为选择标记基因。; 2)营养缺陷型检测筛选法 根据缺陷型菌株的特性在载体组入与细菌营养代谢有关的基因或在培养基中加入某种营养成分从而将转化的克隆子筛选出来。 3) 嗜菌斑筛选法 对嗜菌体克隆载体的筛选，根据形成嗜菌斑的特性来进行筛选。;2.重组子质粒特性分析筛选法;3.核酸分子杂交筛选法;1) 放射性探针 特点：高灵敏度，放射污染，半衰期短 放射性探针标记物： 放射性元素：32P，35S，125I 放射性标记物： 32P标记的dNTPs 35S，125I 标记的抗体蛋白;常见的放射性标记物;放射性探针的制备;末端标记法制备DNA探针;b）置换合成法-切口平移 原理：双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶I可以把核苷酸残基加到切口处的3’端，同时该酶具有5’-3’外切酶活性，从切口处的5’端除去核苷酸，5’核苷酸的除去与3’端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿DNA链平行移动。;切口平移合成探针;c）随机寡核苷酸引物合成法 原理：利用随机寡核苷酸引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）的作用下，沿单链DNA