酵母基因工程1.docVIP

酵母基因工程 一 酵母基因工程的发展现状 1.酿酒酵母自身的改造 （1）将葡萄糖淀粉酶基因导入酿酒酵母 （2）将外源的蛋白水解酶基因导入酿酒酵母 （3）将β—葡聚糖酶基因导入酵母 （4）将ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在酿酒酵母体内表达 （5）将人血清清蛋白（HAS）的基因转化到酿酒酵母 2酵母表达异源蛋白 （1）表达水平 （2）表达质量 2酵母基因工程的发展趋势 解决酵母基因工程中还存在的缺陷 在人类基因组计划中的应用研究是一个重要的发展方向 利用酵母基因工程筛选更多新药 改造酿酒酵母自身，降低生产酒精的成本 酵母的生理承受极限研究引起人们的关注 3发展历程 1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。 1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。 1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。 我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。 1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。 二．酵母基因工程的优点 安全无毒，不致病； 有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率； 培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能 三．酵母表达系统 （1）酵母表达载体 载体的基本构架：大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。 原核部分：大肠杆菌中复制的起点序列(ori)和抗生素抗性基因序列。 酵母部分： 1酵母菌中维持复制的元件：2μ质粒复制起点；自主复制序列(ARS)；整合型载体的整合介导区。 2营养缺陷型基因序列、抗生素抗性基因序列 3基因启动子和终止子序列 4信号肽序列 载体的复制形式 附加型载体：在酵母染色体外自主复制 1酿酒酵母2μ质粒的DNA的复制元件所构建的 2酵母基因组DNA的自主复制序列ARS所构建的 整合型载体：随同酵母染色体一起复制 1含有与受体菌基因组有某种程度同源性的一段DNA序列，介导载体与宿主染色体之间发生同源重组。 2常用的外源基因整合靶位点：rDNA （2）宿主 广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 酵母属酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 克鲁维酵母属乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 毕赤酵母属巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 裂殖酵母属非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 汉逊酵母属多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想 （3）酵母DNA转化 原生质体法：早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2% 离子溶液法:酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA。 103~104个转化子/μg DNA 电穿孔法(electroporation)和粒子轰击法(particle bombardment)：酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA。105个转化子/μg DNA （4）酵母分泌外源蛋白的糖基化 1酿酒酵母分泌的多数外源蛋白均是过度糖基化的(40个甘露糖残基)； 2巴斯德毕赤酵母分泌表达糖蛋白的寡糖链平均长度约为8~14个甘露糖残基 3解脂耶氏酵母外源蛋白金含短的寡糖链(8~10个甘露糖残基) 酿酒酵母分泌的外源糖蛋白不适合作为药物治疗使用。 四、酿酒酵母表达系统 （1）、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 酿酒酵母是发酵工业中的主要生产菌株，是最先建立的酵母表达系统。 应用：乙型肝炎疫苗、人胰岛素、粒细胞集落刺激因子 酵母表达系统的不足 较难进行高密度发酵：发酵时产生乙醇，影响生长代谢和基因产物表达； 蛋白质的分泌表达能力较差； 蛋白质的加工过程发生过度糖基化作用。 表达盒式结构组成： 启动子常用乙醇脱氢酶启动子(PADH1)和半乳糖诱导型启动子(PGAL)。 分泌信号用酿酒酵母自身α-交配因子 的分泌信号 终止子用CYC1基因 的转录终止子 (2)、巴斯德毕赤酵母表达系统 1、巴斯德毕赤酵母 巴斯德毕赤酵母 是一种甲基 营养菌，能在低廉的甲醇 培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的