金银花内生真菌分离及其次生代谢产物相关性研究分析.doc

金银花内生菌分离及其次生代谢产物相关性研究 摘要：本文以封丘、密县两个不同产地的金银花根、茎、叶、花为实验材料，用平板划线法、点植法进行分离。实验中设立对照：吸取少量表面消毒中最后一次冲洗材料的无菌水，涂布于培养基上，经培养若无微生物长出，表明表面消毒彻底，分离到的是内生菌。经过反复分离、筛选、纯化出107 株内生菌，结合菌落观察和镜检结果去除重复共86株内生菌；对86株内生菌进行发酵后，用TLC法检测，结果显示次生代谢产物与绿原酸比移值相同的菌株有3株，编号为：A-3-24，B-4-15，B-4-31，次生代谢产物与木犀草苷比移值相同的菌株有1株，编号为A-2-22。为了验证次生代谢产物，本文进一步用HPLC法对次生代谢产物进行检查，检测结果与TLC法结果一致。根据菌落、菌丝体、孢子形态特征，初步将其鉴定到属水平，其中产绿原酸菌株A-3-24为毛霉属，B-4-15为曲霉属，B-4-31为青霉属，产木犀草苷菌株为尾孢属。为了使内生菌产生此生代谢产物的效率更高，本文对内生菌二次发酵的培养基即：碳源、氮源以及培养温度进一步做了考察，最终确定发酵培养基为PDB培养基，培养条件为28℃,120r/min，震荡培养72小时。 关键词：金银花 内生菌 绿原酸 木犀草苷 1 问题的提出 2009年10月24日上午“中医中药中国行”郑州绿城广场举行，我和几个同学怀着好奇心参观了河南名药展示区，在展区我认识了河南中医学院的董诚明教授，通过他的介绍，使我第一次对道地药材有了一个新的认识，他看我对药材兴趣比较浓厚，就建议我到他们学校的中药标本馆看看，于是我利用了一个周六的时间来到了他们的标本馆，深深感受到我国中医药的博大精深，了解河南是我国中医药的发祥地之一，而且有许多道地药材分布，也被一种开着银色和金黄色花的植物所吸引，通过了解知道它也是一种我们河南产的道地药材叫金银花，具有清热解毒、通经活络、广谱抗菌及抗病毒等功效，70%以上的感冒、消炎中成药中都含有金银花。具有“中药抗生素”、“绿色抗菌素”之称。金银花的作用除药用外，其美容、减肥和保健养生的作用更为神奇，对身体所起到的巨大保护和修复作用是十分显著的。金银花既然有如此之多的用途， 它起作用的化学成分什么？通过请教老师和查阅资料，得知金银花所含绿原酸的生物活性，能促进人体新陈代谢、调节人体功能、提高免疫力。既然清楚绿原酸是金银花的活性成分，它在植物体内时如何产生的，于是我想起生物课上老师曾经讲解到土壤中有大量的微生物存在，而且在植物体内也一类微生物存活于健康植物组织内部，在长期进化过程中与寄主协同进化，在演化过程中两者形成了互惠共生关系，此类微生物称为内生菌。那么在金银花中有没有能产生绿原酸的内生菌。那如果能把该菌分离出来，就可以利用微生物发酵生产金银花中活性成分绿原酸了。那样就可以节约大量的土地和劳动力，又能实行工厂化生产。那么，采用什么样的技术才能分离出产绿原酸的金银花内生菌并进行培养发酵呢？ 于是便开始了我的研究历程。 2 研究进展与研究思路 内生菌(endophyte)是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物。内生菌也可理解为植物组织内的正常菌群，它们与植物的关系相当密切，是植物微生态系统的天然组成成分。关于内生菌的起源仍然有不同的观点，存在两种假说，即“内生说’’和“外生说”:内生说认为内生菌与宿主植物应该具有相同或相似的遗传背景；外生说认为内生菌源于植物体外，通过植物体表、根际的自然孔口、伤口或诱导植物形成的通道进入体内。研究发现某些内生菌可以产生与宿主植物相同或类似的产物，这一发现可能一定程度上解决了药物来源短缺的问题。近年来先后从红豆杉，长春花等药用植物中分离得到了内生真菌，并从这些药用植物内生真菌中分离得到了和宿主植物研究相同或相似的活性成分。内生菌作为许多重要药用成分的新来源，可工业化生产而不受土壤气候以及资源的限制，从而缓解了药源的短缺。目前已经从红豆杉、长春花、银杏等植物中分离出产生活性成分的内生真菌【1-3】。1993年Stiede首次从短叶红豆杉(Taxus breviflia)中分离得到一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真菌(Taxomyces andreanae)，此后对东北红豆杉也进行了研究[3]。云南大学张玲琪等从桃儿七Sinopodophyllum hexandrum的茎中分离到能够产生鬼臼毒素的内生真菌[4，5，6]。从长春花植株中分离出21株真菌，其中有4 株能够产生长春新碱类似物，它们分别属于镰刀菌属、交链孢属和无孢菌群等， 从桃儿七植株中共分离得到28株真菌，其中有两株能够产生鬼臼毒素类似物，它们分别属于青霉属和交链孢属。1999年，中山大学王伟等人从南方红豆杉(Tchinensis va