大豆天冬酰胺合成酶B基因的克隆及在大肠杆菌中的表达.pdfVIP

第44卷第7期 东 北 农 业 大 学 学 报 44(7)：17-21 2013年7月 JournalofNortheastAgriculturalUniversity July2013 网络出版时间2013—7—1118：46：00 [URL]http：／w／ww．cnki．net／kcms／detail／23．1391．S1846．014．html 大豆天冬酰胺合成酶j!}基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 张 继 ，王相晶 ，于 丹 ，王 晴 ，向文胜 (1．东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2．黑龙江农业职业技术学院，黑龙江佳木斯 154007) 摘 要：根据GenBank登陆大豆天冬酰胺合成酶 (AS—B)基因序列(登录号：GMU55874)设计特异引物，通过 PCR扩增从大豆(Glycinemax)cDNA中克隆出 Js— 基 因。将该基 因克隆到pET30a(+)载体 ，构建重组表达 栽体pET30a—AS，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS，并进行表达条件优化。结果表明，在 16℃条件下，经0．5 mmol·L-IPTG诱导 14h，大部分重组AS—B以可溶性蛋 白的形式存在。经Ni—NTA亲和层析和SephadexG50脱 盐后 ，重组蛋白产率为23．4mg·L-，纯度90％，以L_谷氨酰胺和NH4Cl为氮源供体时，其比活力分别为2．32和 2．60p~molm·in-m·g-。研究结果为研究大豆As—B结构与功能和酶催化动力学机制及建立AS—B抑制剂的高通量筛 选平台奠定基础。 关键词：天冬酰胺合成酶B；克隆；表达 中图分类号：Q786 文献标志码 ：A 文章编号：1005—9369(2013)07—0017—05 张继，王相晶，于丹，等．大豆天冬酰胺合成酶B基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 J【】_东北农业大学学报，2013，44(7)：17—21． ZhangJi，WangXiangjing，YuDan，eta1．CloneofsoybeanasparaginesynthetaseBgeneanditsexpressioninE．cohlJ】 JoumalofNo~heastAgriculturalUniversitY,2013，44(7)：17-21．(inChinesewithEnglishabstract) CloneofsoybeanasparaginesynthetaseBgeneanditsexpressionin E．coli／zHANGJi’，WANGXiangjing’，YUDan，WANGQing’，XIANGWensheng’(1．SchoolofLife Sciences，NortheastAgdculturalUniversity,Harbin 150030，China；2．HeilongjiangAgricultural VocationalandTechniaclCollege，JiamusiHeilongjiang154007，China) Abstract：Accordingtothesequenceofasparaginesynthetase(AS—B)geneinsoybean(GenBank accessionnumber：GMU55874)．apairofspecificprimerswasdesignedtoobtaintheAS—Bgenefrom GlycinemaxbyPCR amplification using cDNA astemplate．The geneofAS—Bwasthen cloned into prokaryoticexpressionvectorpET30a(+)，constructingareocmbinantexpressionvectorpET30a．AS，which wasintroducedintoE co／／RoseRa(DE3)pLysS．Aftertheoptimizat