余甘根苷B抗柯萨奇病毒B3活性及机制的初步研究.pdfVIP

余甘根苷 B 抗柯萨奇病毒 B3 活性及机制的初步研究 中文摘要 研究背景和目的 病毒性心肌炎是由病毒侵犯心脏所引起的，以心肌急性或慢性炎性病变为主要表现的 疾病，约有 50%的病毒性心肌炎由柯萨奇病毒B3 （coxsackievirus B3，CVB3 ）所致。病 毒性心肌炎在儿童及青壮年中发病率较高，可导致急性猝死及扩张型心肌病，其发病机制 尚不明确，而目前临床还没有特效药物及其治疗方法，因此研究开发安全有效的抗CVB3 药物用于临床是极其重要的。 余甘子（Phyllanthus em blica L. ）是中国的传统中药材，在养生、保健和治病方面具 有重要的药用价值。余甘根苷 B 及其类似物是从余甘子根中提取的一系列倍半萜类化合 物，其中余甘根苷 B 经结构鉴定已确认是一种新化合物，对其抗病毒活性尚未有研究报 道。 本研究分别构建病毒性心肌炎的体外细胞模型和动物体内模型，对余甘根苷 B 的抗 CVB3 活性进行研究，并观察余甘根苷 B 对 CVB3 感染后宿主细胞凋亡情况的影响，初 步探讨余甘根苷 B 抗 CVB3 的作用及其机制，为将来应用于临床提供科学的理论依据。 实验方法 1. 体外实验 （1）药效学实验 以 CVB3 感染培养的 Hela 细胞建立体外病毒性心肌炎模型，采用细胞病变（CPE ） 法及 MTT 法检测细胞存活率。并通过药物在加入病毒前、后及药物与病毒同时加入细胞 三种作用方式，检测余甘根苷 B 及其类似物的抗 CVB3 活性。 以 CVB3 感染原代培养的 SD 大鼠乳鼠心肌细胞建立体外病毒性心肌炎模型。观察 CPE 以及测定心肌细胞释放天冬氨酸氨基转移酶（AST ）和乳酸脱氢酶（LDH ）的水平， 检测余甘根苷 B 对心肌细胞的保护作用。 （2 ）机制研究 选择余甘根苷 B 有效剂量进行实验，应用流式细胞仪通过 Annexin V/PI 双重染色法 检测细胞凋亡率；采用蛋白质组学的方法、Real-time PCR 、Western-blot 检测余甘根苷 B I 余甘根苷 B 抗柯萨奇病毒 B3 活性及机制的初步研究 对 CVB3 感染细胞凋亡的影响。 2. 动物体内实验 （1）药效学实验 通过给 Balb/c 小鼠腹腔注射 CVB3 的方法建立 CVB3 病毒性心肌炎动物模型，通过 观察实验动物一般生存状况，测定血清中乳酸脱氢酶（LDH ）和肌酸激酶（CK ）水平， 心肌组织中病毒滴度，以及心肌组织形态学改变，检测余甘根苷 B 对病毒性心肌炎小鼠 的治疗作用。 （2 ）机制研究 选择余甘根苷 B 有效剂量进行实验，采用 TUNEL 原位末端标记法对心肌组织进行凋 亡形态学观察与分析，免疫组织化学法检测心肌组织 caspase-3 和 bcl-2 蛋白表达情况，以 确定余甘根苷 B 对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡的影响。 实验结果 1. 体外实验 （1）药效学实验结果 余甘根苷B 及其类似物均具有显著的抗CVB3 活性，IC50 分别为 50.30μg/ml 、 195.62μg/ml、67.65μg/ml及 50.23μg/ml，TI分别为 9.21、8.96、6.20 和 6.46 。三种作用方 式结果显示，余甘根苷B及其类似物均可以抑制CVB3 增殖，并对CVB3 具有直接杀灭作 用，但是不具有抑制CVB3 吸附的作用。 采用 CPE 法观察到余甘根苷 B 可以减轻 CVB3 感染心肌细胞所致的细胞病变，并能 降低心肌细胞释放AST 和 LDH 的水平，对CVB3 感染的心肌细胞具有明显的保护作用。 （2 ）机制研究结果 经流式细胞仪 Annexin V/PI 双重染色法检测结果显示余甘根苷 B 可显著降低 CVB3 感染细胞的凋亡率；蛋白质组学结果显示余甘根苷 B 可促进一些抑制凋亡的蛋白表达， 抑制某些 CVB3 蛋白的表达；Real-time PCR 、Western-blot 结果显示余甘根苷 B 可以在基 因及蛋白水平抑制CVB3 感染细胞 caspase-3 的表达，促进bcl-2 的表达。 2. 动物体内实验 （1）药效学实验结果