复制缺陷型腺病毒PCA的构建及其对结肠癌细胞生长的影响.pdfVIP

浙江理工大学学报，第30卷，第6期，2013年11月 of Sci—Tech Journal Zhejiang University V01．30，No．6，Nov．2013 文章编号：1673—3851(2013)06—0901—05 复制缺陷型腺病毒PCA的构建及其对结肠癌 细胞生长的影响 黄越，陈文铎，周炜，董淼，高永，许韶威，徐涛，唐斌 (浙江理工大学生命科学学院，杭州310018) 摘要：通过同源重组方式，利用Adeasy系统成功构建携带p14ARF基因的复制缺陷型腺病毒，命名为Ad— 长抑制现象，并呈现出时间和浓度依赖性；Hoechst染色后观察到细胞内出现凋亡小体，并且数目随药物处理浓度的 升高而增多。 关键词：Ad-p14一ARF；结肠癌；MTT；结晶紫染色；细胞凋亡 中图分类号：Q789 文献标志码：A 0 引 言 便于基因克隆的操作；(2)在多种人类肿瘤中缺失 结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，在西方国家 表达；(3)是目前发现最为重要的抑癌基因p53的 它是癌症引发死亡的“第三大杀手”，在我国发病率 上游调节基因，因此符合抑癌基因治疗对目的基因 也呈逐年增长的趋势[1之]。目前主要的治疗方法是 片段的要求，有望在恶性肿瘤的基因治疗中发挥重 手术和化疗。但是对于晚期结肠癌，无法进行手术 要作用。 且化疗疗效欠佳，因此寻求高效、低毒的治疗方法迫 本实验在以上理论的基础上，利用AdEasy系 在眉睫。基因治疗[3]通过载体携带基因来治疗疾 病，此概念一经提出，很快受到重视，并开始应用于 肿瘤治疗。 HT-29的生长抑制效应。 p14ARF[4]是1995年发现的一种重要的细胞周 1材料与方法 期负调控基因，主要将细胞阻滞于G。期和G。／M 1．1材料 期。p14ARF定位于染色体9p21的INK4A—ARF 基因位点，其cDNA长度为399bp，编码132个氨1．1．1细胞、菌株和质粒 000 基酸，分子量约14 Da。分子病理学和分子流行 病学研究发现，p14ARF蛋白表达的异常与多种恶 细胞生物学研究所提供；质粒pMDl8一T_p14，E． ∞zistrain strain 性肿瘤的发生、发展有密切关系[5。]。动物实验也表 DH5a和E．∞ziBJ5183由本实验 明，敲除p14ARF的小鼠肿瘤患病率明显上升[8|。 收稿日期：2012—12—10 基金项目：国家自然基金资助项目 作者简介：黄越(1986一)，女，吉林四平人，硕士研究生，主要从事天然药物抗肿瘤活性研究。 cn 通信作者：徐涛，电子邮箱：pkuxt@”hoo．corrL 万方数据 902 浙江理工大学学报 2013年第30卷 echst 33258购自Sigma公司。 1．1．2试剂 重组腺病毒。病毒的体外扩增选用293A细胞，并 DNA小量抽提试剂(捷瑞公司)；DNA提取凝 采用TCID50法测定病毒滴度。 胶试剂盒(爱思进公司)；PCR产物纯化试剂盒(爱1．2．5MTT法检测细胞增殖 思进公司)；DNA Ladder ligationkit及DNA 收集对数生长期细胞，调整