水稻端粒酶RNA候选序列的克隆及特征解析.pdfVIP

浙江理工大学学报，第30卷，第4期，2013年7月 Journalof Sei—Tech Zh@ang University V01．30，No．4，Jul．2013 文章编号：1673—3851(2013)04—0579—06 水稻端粒酶RNA候选序列的克隆及特征解析 马登旭，杨力媛，马国兴，郑洁，应畅，刘小川 (浙江理工大学生命科学学院生物工程研究所，杭州310018) 摘要：端粒酶是由端粒酶反转录酶和端粒酶RNA构成，端粒酶RNA中含有端粒合成所需的模板序列。现 仅获得了拟南芥的端粒酶RNA序列。为了建立快速有效的富集植物端粒酶的方法并克隆水稻的端粒酶RNA序 列，研究中使用不同浓度的PElG6000选择性的沉淀端粒酶萃取液中的杂蛋白。结果表明-3PEG6000浓度为4％时， rRNA和18S 端粒酶活力最高，并可以有效降低核糖体28S rRNA的干扰。从端粒酶蛋白液中提取IⅢA，并在其3’ 端连接接头，在模板区设计上游引物，PCR扩增获得一条292bp的未知片段，其中含有端粒模板序列 5-AAACCC丌AA一3’。将该片段及拟南芥端粒酶RNA的转录调控区进行序列比对分析发现，两者具有类似的转录 调控元件。因此，初步判定292bp的目的片段为水稻端粒酶RNA的模板下游序列。 关键词：水稻；PBG6000；端粒酶RNA；特征解析 中图分类号：Q781 文献标志码：A 方面，不同物种的TER在大小和序列上存在着显 0 引 言 著的差异，然而对线虫、酵母和脊椎动物的TER进 端粒酶是一种RNA依赖性的DNA聚合酶，由行系统进化分析发现，TER的二级结构中存在多个 reverse 端粒酶反转录酶(telomerasetranscriptase，保守结构域。这些保守结构包括端粒模板区、5’模 TERT)和端粒酶RNA(te|omeraseRNA，TER)构板边界元素、含有模板序列的大环、一个潜在的假结 成，其功能是催化端粒序列的合成。端粒是位于染 和一个闭合环状螺旋区[8-10]。最近有报道称，拟南芥 色体末端的重复序列，在细胞周期的大多数时间，端 端粒酶中可能存在两种TIR形式一n浆1和TI娘2， 粒均以环状的形式存在以保护易受攻击的染色体末 端[1]。通过对拟南芥、水稻、玉米、大麦等多种植物 端粒合成时TERl是主要的模板提供者[11J。因此， 的研究发现，端粒酶主要分布在细胞分裂旺盛的分 获取更多植物端粒酶RNA的序列信息并进行系统的 生组织中[2’3]，在愈伤组织中也有较高的端粒酶活分析，对进一步阐述其结构与功能具有重要的意义。 力[4]。动植物端粒酶在细胞生长过程中发挥着类似 本研究的目的是探究一种快速有效的分离纯化 的作用，但是两者端粒酶活力的表达调控有着明显 植物端粒酶的方法，克隆水稻的端粒酶RNA，并通过 的差异。成熟的植物细胞端粒酶活力较低，但是在 生物信息学技术预测分析水稻与拟南芥端粒酶RNA 诱导脱分化和再分化的过程中则可以恢复端粒酶活 的转录调控元件。核糖体是影响端粒酶富集及端粒 力，这也反映了植物细胞全能性的特点[5]。 酶耐蛆克隆的主要因素。研究中利用核糖体大小亚 根据同源蛋白的序列保守性，现已克隆到了拟 基偶联及解聚的动态平衡受镁离子浓度调控的机 南芥和水稻的端粒酶反转录酶基因，但是在部分植 制[121，提高裂解液中镁离子的浓度，使核糖体大小亚 物中发现TERT基因的转录产物还存在选择性剪基最大程度的偶联在一起。然后，使用不同工作浓度 切现象，这种机制仍不清楚E4,6-7]。在端粒酶RNA的PEG6000选择性沉淀不同分子量的蛋白，期望获 收稿日期：2012—11--07 作者简介：马登旭(1985一)，男，山东济宁人，硕士研究生，主要从事端粒及端粒酶的分子遗传研究。 通信作者：刘小川