组成型激活基因DREB2A载体的构建及其对烟草的遗传转化.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（１１）：４２４８ 组成型激活基因ＤＲＥＢ２Ａ载体的构建 及其对烟草的遗传转化 １，２ ２ ２ ２ 赵　清 　王　罡 　季　静 　金　超 （１天津大学化工学院　天津　３０００７２　２天津大学农业与生物工程学院　天津　３０００７２） 摘要　为探索ＤＲＥＢ２ＡＣＡ基因（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅａｃｔｉｖａｔｅＤＲＥＢ２Ａ，组成型激活ＤＲＥＢ２Ａ基因）在植物 抗盐反应中的功能及其在植物抗逆基因工程中的运用，用ＳＯＥＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲ，折 叠延伸ＰＣＲ）方法克隆了ＤＲＥＢ２ＡＣＡ，并将其置于盐诱导的ｒｄ２９Ａ启动子控制下，构建了植物表达 载体，并通过农杆菌介导的方法将目的基因转入烟草。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明了目的基因成功整合到 烟草基因组中。ＲＴＰＣＲ表明，目的基因受盐胁迫诱导表达。在盐处理条件下，转基因烟草比对 照具有更好的生长状态，含有较高的光和色素，具有较高的光合速率及较低的ＭＤＡ含量。说明 ＤＲＥＢ２ＡＣＡ的表达提高了植物抗逆能力，该基因在抗盐领域具有广阔的应用前景。 关键词　ＤＲＥＢ２Ａ　转基因　烟草　抗盐 中图分类号　Ｑ７８ 　　植物直接生活在复杂多变的自然环境中。干旱、 动一系列下游抗逆基因的表达，并赋予植物耐盐、干 盐碱、寒冷及高温等逆境会使植物受到生理伤害，严重 旱、寒冷、高温等能力［５６］。在植物抗盐基因工程领域， 时甚至导致植物死亡。为适应逆境，植物在漫长的进 ＤＲＥＢ家族基因一直备受关注，研究者通过转基因手段 化过程中演化出了对这些逆境胁迫的应答机制，例如： 将ＤＲＥＢ导入植物基因组中，得到了许多抗性增强的 ［１］ 转基因品种。目前已从多个物种中克隆到ＤＲＥＢ１基 气孔关闭、细胞膜及胞质成分的改变等 。一般认为， 与植物抗病机制不同，植物对干旱、高盐等逆境的抗性 因家族相关基因，这些基因能赋予转基因植物抗旱，抗 ［７９］ 受多基因控制，因此，利用基因工程技术导入单个功能 盐，抗寒冷等多重效应 。 基因难以大幅度地提高植物的抗逆性。而强表达信号 　　与 ＣＢＦ／ＤＲＥＢ１转录因子相比，ＤＲＥＢ２亚家族的 调控途径中的上游基因，如转录因子，则能诱导下游抗 调控机制及其转基因研究发展较为滞后。在 １９９８年， ［６］ 逆相关的许多功能基因的表达，因此利用转录因子成 Ｌｉｕ等 用酵母二元杂交的方法克隆到了ＤＲＥＢ２Ａ，而 ［２］ ［１０］ 为改良植物抗逆性的重要途径 。 对该基因功能详细的描述到 ２００６年才有报道 。 ［１０］ 　　在对逆境胁迫基因启动子区分析的研究中，发现 Ｓａｋｕｍａ等 用拟南芥原生质体鉴定出ＤＲＥＢ２Ａ１３６～ 许多基因的启动子区含有保守元件序列：Ａ／ＧＣＣＧＡＣ， １６５位残基的缺失将使它转变成组成性活性形式即 这就是后来称之为脱水应答元件（ＤＲＥ）的核心序 ＤＲＥＢ２ＡＣＡ （ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅａｃｔｉｖｅＤＲＥＢ２Ａ）；强 表 达 ［３］ ［４］ ＤＲＥＢ２ＡＣＡ的拟南芥，抗盐能力要比强表达 ＤＲＥＢ２Ａ 列 。自从１９９７年，Ｓｔｏｃｋｉｎｇ等 用酵母一元杂交的 方法从拟南芥中分离了一个ＤＲＥ／Ｃ