小干松SRAP—PCR反应体系的建立.pdfVIP

北方 园艺2013(02)：83～86 ·生物技术 · 小干松 SRAP—PCR反应体 系的建立 王 骞 春 ，黄 夏 ，李 光 森 (1．辽宁省林业科学研究院，辽宁 沈阳 110032；2．辽宁省实验林场 ，辽宁 弯甸子 113311) 摘 要：以小干松针叶基因组DNA为模板 ，采用 L。(4)正交实验设计 ，对 SRAP—PCR反应 体系中的Taq酶、Me 、dNTPs、模板DNA和引物5个因素在4个水平上进行优化。结果表明： 小干松 SRAP-PCR2O L反应体 系最佳组合为：Taq酶 0．5U，M 浓度 2．5mmol／L，dNTPs浓 度0．15mmol／L，模板 DNA含量6Ong，引物0．2umol／L。使用 12对SRAP引物，采用优化后的 体系进行SRAP_P(、R反应，表明优化的体 系很好地满足 了小干松基因组DNA进行SRAP的扩增 要求。 关键词：小干松；SRAP；反应体系 中图分类号 ：S791．256 文献标识码：A 文章编号：1001--0009(2013)O2一O083一O4 小干松(Pinuscontorta)属松科松属植物，为二针松， 9O和 120ng置于--20℃条件下备用。 又名扭松、北美黑松。原产地为北美，水平分布在北纬 1．2．2 SRAP-PCR反应体系正交实验 随机选取了正 31。～64。和西经 107。～140。地域，垂直分布海拔0～3600iTt 向引物 ME1：5一TGAGTCCAAAC(GGA1 一3和反向引 的广大地区，具有抗旱、抗寒、抗病和抗污染等特性。小 物 EM3：5一GA TACGA AC一3组合。扩增 于松有4个变种，各变种间形态和抗性有明显差异L】]。 程序 ：94℃预变性 5rain；94℃变性 1min，35℃复性 SRAP标记 (Sequence—RelatedAmplifiedPolymorphism) 1rain，72℃延伸 1min，5个循环 ；94℃变性 1min，50℃复 是由Li等L2]在 2001年提出的一种基于 PCR的分子标 性 1min，72℃延伸 1m_in，35个循环，最后 72℃延伸 记技术 。该方法具有高共显、中产率、多态性高和重复 10min，4℃保存。SRAP-PCR产物用 8 聚丙烯酰胺凝 性好的特点，已被广泛应用在遗传多样性分析、遗传 图 胶电泳分离，电泳后经银染、显影后拍照分析。 谱构建和基因定位、基因分离、品种鉴定等研究工作。 1．3 数据分析 多种植物的SRAP-PCR反应体系已经建立，但在小于松 参照何正文等[4的方法，根据 PCR产物扩增条带 中鲜见报道。该研究 旨在建立小干松的SRAP—PCR反 的数量、特异性、清晰度作为评分标准，分为 1～16个等 应体系，为小于松引种、育种工作 中的种源分类和鉴定 级。条带数量最多、特异性好、并且最清晰的处理记为 以及其它科学研究奠定基础。 16分，相反最差的记为 1分，2次重复试验分别独立统 1 材料与方法 计。根据评分进行正交直观分析。 1．1 试验材料 2 结果与分析 2011年在辽宁省灯塔市铧子林场采集小干松当年 2．1 SRAP-PCR扩增效果及评分 新发针叶作为试验材料，保存于一80℃超低温冰箱内。 小干松sRAP—PCR反应体系扩增结果见图 1。依 用于 SRAP—PCR反应 的 1O×PCRbuffer、MgC12、 处理次序得到的2次分数分别记为：4、4、6、5、6、8、4、16、 Taq酶和 dNTPs购 自天根生化科技 (北京)有限公司， 13、9、5、1、l1、4、15、12；3、5、6、5、5、8、3、16、13、9、5、1、11、 SRAP