GPER-shRNA载体的构建及其对血管内皮细胞增殖的影响.pdfVIP

· 954 · JClinCardio1(China)，I)ec20¨，Vol27，No12 GPER—shRNA载体的构建及其对血管 内皮细胞增殖的影响 黄俊 鲁爱粉 张明霞 万欢 黄江艳 [摘要] 目的：构建 GPER-shRNA载体并研究其对血管 内皮细胞增殖 的影响。方法 ：化学合成靶 向GPER 的短发夹 RNA的寡核苷酸序列，退火与线性化 pSUPER质粒连接 ，行双酶切及测序鉴定 ；脂质体法转染血管 内 皮细胞 (VEC)，WesternBlot鉴定重组质粒 的功能，MTT法测定其对 VEC增殖情况 的影响。结果：重组质粒经 酶切及测序分析，表明目的核苷酸序列成功插入了预计位点且序列完全一致；重组质粒成功转染 VEC，Western Blot检测显示GPER基因蛋 白表达明显降低，pSUPER—GPER一2组抑制效果明显，其抑制率为 84．2 ，与对照组 相 比差异有统计学意义(P0．05)，并显著抑制 了VEC的增殖 。结论 ：GPER—shRNA载体构建成功，井 可抑制 VEC的增殖 。 [关键词] G蛋 白偶联雌激素受体 30；RNA干扰 ；血管内皮细胞 [中图分类号] R34 [文献标志码] A [文章编号] 1001—1439(2011 G蛋 白偶联雌激素受体 30(G-protein—coupled 加间隔序列及两端保护碱基及酶切黏性末端 (序列 receptor30)，也称 GPR30，正式名称为 GPER，是 如下)，进而合成 4条编码短发夹 RNA(shothair— 2005年提出的一种新型的雌激素受体亚型，由具有 pinRNA，shRNA)的DNA 单链 ，互补成对 ，其序 高亲和性的雌激素膜蛋 白组成 。。GPER表达于 列如下 ： 血管内皮细胞 中，可促进血管 内皮细胞的增殖H 。 GPER1一Forward：5一(；ATCCGCATGTACAG— 本研究拟构建 GPER—shRNA载体 (人与小鼠共用) CAGCGTCTTCT，厂(AA(AGAGAAGACG TC ( |1一 并研究其对血管内皮细胞增殖 的影 响，为后期的多 GTACATGTTTTTTGGAAA一3 ，(PERl—Reverse： 项研究奠定基础，并提供重要 的工具。 5，_AGCTTTTCCAAAAAA CATGTACAGCAGCG— 1 材料与方法 TCTTCTCTCT了’GAAGAAGACGCTGCTG1AIC G 1．1 材料 CG一3；GPER2一Forward：5一GATCCGGCCGTCA1- 大肠杆菌 JM109(本实验室保存菌种)，pSU— TCCAGACAGC丁TCAAGAGAGCTGTCTGGAAT— PER质粒 (美 国Oligongine公司)，GPER—RNAi GACGGCCTTTTTTGGAAA一3，(PER2一Reverse： 序列 (上海博亚公司)合成 ，限制性内切酶 (HindIII、 5，．AGCTTTTCCAAAAAA GGCCGTCATTCCAG— Bgl1I、EcoRI)、T4连接酶、DNA凝胶 回收试剂盒 ACAGC』 』C7 』GAAGCI’G’l’Crl’GGAA’I’GACGG— (TAKARA公司)，小 鼠主动脉 内皮细胞 (上海复蒙 CCG一3。 基因生物公司)，人主动脉内皮细胞 (北京裕恒丰科 上述各条链 的黑体字序列即为 19核苷酸的靶 技有 限公司)，PBS缓冲液 、0．05 胰蛋 白酶、1640 序列 ，黑体加 下划线序列为反义互补 ，中问斜体部 培养液、100U／ml青霉素 (Gibco／BRL公司产品)， 分为间隔区，两端为保护碱基及 BglⅡ和 Hind11I酶 胎牛血清 (于杭州 四季青 公司)，Lipofectamine 切黏性末