副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白A基因的分段表达及其免疫原性分析.pdfVIP

畜牧兽医学报 2011，42(12)：1743—1749 ActaVeterinaria etZootechnicaSinica 副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白A基因的分段 表达及其免疫原性分析 辛 伟 ，李 郁，黄晓慧，魏建忠 (安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036) 摘 要 ：本研究 旨在获得副猪嗜血杆菌 (Haemophilusparasuis，HPS)转铁结合蛋 白A基 因 (tbpA)的表达产物 (TbpA)，并对其免疫原性进行分析鉴定。采用生物信息学方法预测 HPS的TbpA抗原表位 ，根据 GenBank上发 表 的HPS(SH0165株)tbpA 的核苷酸序列设计合成 3对 引物 ，用 PCR从安徽省 HPS分离株 (LJ3)tbpA 中分段扩 增 出tbpA1、tbpA2和 tbpA3，并连接到 pET一32a(+)载体上 ，经 BamH I和 EcoRI双酶切鉴定和测序确认 ，将重组 质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)中，进行 IPTG诱导表达。利用 SDS检测 目的蛋 白，Westernblotting分析重 组蛋 白的免疫活性 ；通过小鼠免疫攻毒保护试验和血清杀菌力试验，鉴定重组蛋 白的免疫原性以及诱导机体产生 保护性免疫反应 的能力 。结果表明，从 HPS(LJ3)tbpA 中扩增 出与预期设计 的 1140、897、666bp大小相符 的3个 片段 (tbpA1、tbpA2、tbpA3)，扩增产物连接载体得到重组质粒 ，在大肠杆菌 中实现表达 ，获得大小为 62、54、44ku 的 目的蛋 白(rTbpA1、rTbpA2、rTbpA3)，均能与 HPS阳性血清反应 。rTbpA1与 甲醛灭活菌体对小 鼠免疫攻毒 的 保护率分别为 2O 和4O ，但 rTbpA1引起小 鼠平均死亡时间显著延迟 ，兔抗 rTbpA1与兔抗 HPS(LJ3)血清具有 同样显著的杀菌活性。结果显示 ，成功表达的rTbpA1、rTbpA2、rTbpA3均具有 良好的反应原性，其中rTbpA1更 具有 良好的免疫原性以及诱导机体产生保护性免疫反应的能力，可望成为副猪嗜血杆菌病疫苗和血清学检测的候 选成分 。 关键词 ：副猪嗜血杆菌；转铁结合蛋 白A基因；表达 ；免疫原性鉴定 中图分类号 ：$852．61 文献标识码 ：A 文章编号：0366-6964(2011)12-1743—07 ExpressionandImmunogenicityofTransferrin—bindingProtein A Geneof Haemophilusparasuis XIN Wei，LIYu，HUANG Xiao-hui，WEIJian-zhong (CollegeofAnimalScienceandTechnology，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China) Abstract：Anexperimentwasconductedtoexpresstransferrin—bindingproteinA (TbpA)ofHae— mophilusparasuis (HPS)and investigate itsimmunogenicity．Threepairsofspecificprimers weredesignedaccordingtothetbpA genesequenceofHPS SH0165strain from GenBank，three fragmentsoftbpA1，tbpA2 and tbpA3 containingmultipleantigen epitopeswereaccquiredby PCR andcloned intopET一32a(+ )vectorrespectively．Itwasconfirmedthatthreefragments wereinsertedintotheprokaryoticexpression vectorcorrectlybyusingRes