水牛睾丸特异乳酸脱氢酶-C基因选择性剪接体的克隆与序列分析.pdfVIP

《黑龙江畜牧兽医》科技版 2011年 12月(上)47 牛睾 特异乳酸脱氢酶一 基园选择性 剪接俸 隆与序 纷析 洪 键 ，石 云 ，李明梅 ，陆晓东 ，郑玉才 (1．盐城师范学院江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室，江苏 盐城224002； 2．盐城卫生职业技术学院，江苏 盐城224006；3．西南民族大学，成都 610041) 中图分类号：$823．83 文献标识码：B 文章编号：1004—7034(2011)12—0047—03 关键词：水牛；睾丸；乳酸脱氢酶一C(LDH—C) 摘 要：为了克隆水牛睾丸特异乳酸脱氢酶一c(LDH—C)基因选择性剪接体，试验采用RT—PCR方 法从水牛睾丸组织中克隆睾丸特异LDH—c基因的cDNA序列，发现 1种LDH—C剪接体。根据 LDH—C基因在进化上的保守性，参照普通牛LDH—C基因结构分析了水牛LDH—C基因的选择性 剪接体的结构。结果表明：该剪接体缺失第7个外显子，因为LDH—C4酶的NAD 结合结构域由 LDH—C的外显子2～4编码，酶的活性中心由外显子4编码，所以剪接体包含完整酶的NAD 结合结 构域和酶的活性中心。对水牛睾丸组织LDH同工酶的电泳分析，未检测到潜在的LDH—C剪接体的 表达，推测睾丸组织LDH—C选择性剪接的功能是调控该基因在睾丸中表达的方式之一。 乳酸脱氢酶 (LDH)是一类 四聚体寡聚酶，广泛 接变异体 J。研究报道了水牛LDH—C基因选择性 存在于脊椎动物、植物和细菌中…。LDH属于 仅一 剪接体的克隆结果，现介绍如下。 羟基酸氧化还原酶家族成员，能特异地催化丙酮酸生 1 材料 成乳酸，同时将 1分子的NADH氧化生成NAD 。在 1．1 样品采集 哺乳动物中，LDH存在 3种类型的同工酶亚基： 试验所用成年水牛睾丸 (n=10)采 自江苏省盐 LDH—A、LDH—B和 LDH—C，分另0由A、B、C基因 城市秦南镇屠宰场，置液氮中带回盐城师范学院生命 编码。LDH的分布具有组织特异性，LDH—A主要分 科学学院实验室，所有样品均于一70℃保存。 布在骨骼肌中，LDH—B主要分布在心肌中，LDH—c 1．2 试剂 仅在雄性和雌性动物的生殖细胞中表达，并且以同源 Trizol试剂，Invitrogen公司生产；RNAPCRKit 四聚体的形式显示酶活性，称为LDH—C4。 (AMV)Ver．3．0试剂盒、pMD18一T载体，均由TaKa． 最初，LDH—C4被认为只存在于雄性动物的生 Ra公司生产。 殖细胞 中，而在卵细胞中主要是 LDH—B来表现 2 方法 LDH的活性。但是最近 CoonrodS等H研究表明： 2．1 RNA的提取和 cDNA第 1链的合成 LDH—C基因在卵母细胞的胚泡阶段也有表达，但在 用Trizol试剂按操作说明从睾丸组织中提取总 受精卵中没有表达，并且LDH—C基因在卵母细胞中 RNA，cDNA第 1链按照 RNAPCRKit(AMV)Ver． 的转录水平要低于在雄性动物生殖细胞中的转录水 3．0试剂盒的操作说明合成。 平。此外，在睾丸中虽然也存在LDH—A和LDH—B 2．2 水牛LDH—CcDNA的克隆 的同源四聚体，但LDH—C基因在睾丸中的转录要远 根据普通牛的LDH—C基因序列 (GenBank登录 远大于LDH—A和LDH—B基因 。在牦牛、黄牛 号为XM_517413)设计PCR引物，PCR正向、反向引 睾丸组织中，均克隆到LDH—C基因的多种选择性剪 物序列：5 一ATGTcATCTGTcAAGGAGCAGcT一3，