NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体的构建与表达.pdfVIP

第31卷 第4期 暨南大学学报 (医学版) V01．31 No．4 2010年 8月 JournalofJinanUniversity(MedicineEdition) Aug． 2010 NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体的构建与表达 唐小龙 ， 江振友 ，庞雪云 ， 蓝 锴 ， 欧财文 (1．广东省中医院检验科，广东 广州510120；2．暨南大学医学院微生物学与免疫学教研室，广东广州510632) [摘 要] 目的：运用pADxsi系统构建带人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体。方法：采用基因克隆技术，将 目的基因NGN3从pEGFP一Ⅳl—NGN3质粒上切下连到pShutt~一GFP-CMV上 ，替换 GFP，得到pShmt~．CMV-NGN3；再 将PAX4从pEGFP-N1一PAX4质粒上切下连到系统pShuttle—CMV-NGN3上，得到pShuttle—CMV-NGN3／CMV-PAX4穿梭 质粒；最后将 ^ 7＼j3／ t 从pShuttle—CMV-NGN3／CMV-PAX4转移到ADxsi骨架载体上，得到pADxsi—CMV- J7vG帕 ／ 病毒质粒，然后在293细胞中进行包装与扩增活性病毒，并进行病毒滴度测定。体外感染人脐带 间充质干细胞。逆转录一聚合酶链反应(RTP·CR)与免疫印迹 (Westernblotting)检测 目的基因在细胞内的表达情 况 ，免疫细胞化学与间接荧光法检测 目的分子在细胞内的定位。结果：酶切鉴定和PCR证明重组人NGN3与PAX4 双基因表达腺病毒载体构建正确；RT．PCR与Westernblotting结果显示 目的基因在细胞持续稳定表达；阃接荧光与 免疫化学表明重组腺病毒可高效感染人脐带间充质干细胞，且 目的基因特异性地定位于细胞核内。结论：应用重 组技术成功构建人NGN3与PAX4双基因表达腺病毒载体，且在间充质干细胞内持续而稳定表达。 [关键词] 腺病毒； 神经元素3(NGN3)； 成对盒基因4(PAX4)； 间充质干细胞(MCS) [中图分类号] Q78 [文献标志码】 A [文章编号] 1000—9965(2010)04—0346—06 ConstructionandexpressionofNGN3andPAX4double—gene modifiedadenovirusvectors TANGXiao—long， JIANGZhen—you ， PANGXue—yun ， LANKai， OU Cai—wen (1．ClinicalLaboratory，GuangdongProvinceHospitalofTraditionalChineseMedicine，Guangzhou510120，China； 2．DepartmentofMicrobiologyandImmunoloyg，MedicalCoUege，JinaniUniversity，Guangzhou510632，China) [Abstract] Aim：ToconstructNGN3and double—genemodifiedadenovirusvectorsusingpADxsi system．Methods：Byusinggene-clonetechnology．thetargetgeneNGN3wasobtainedfrom thepEGFP— N ．NGN3plasmid．toreplaceGFP nthepShuttle．GFp．CMv vector，and thushtepShutth．GFP—CMV一 ⅣG．7、73wasconstructed；second。 4wascutofffrompEGFP一Ⅳ1 r4plasmidandwasinsertedinto pShuttle．CMV-NGN3toconstructthepShuttle．CMv—NGN ／CMv—PAX4 shuttleplasmid Final