慢性乙型肝炎患者血清HBV增强子I区分子特征分析.pdfVIP

山东医药 2011年第 51卷第 35期 · 基础研 究 · 慢性 乙型肝炎患者血清 HBV增强子 I区 分子特征分析 余克花 ，周 艳 ，刘金辉 ，姚全 良 (1南昌大学医学院微生物学教研室，南昌330006；2南昌大学第二附属医院) 摘要：目的 分析乙型肝炎病毒基因组中增强子 I区的特征，进一步探讨乙肝慢性化的机制。方法 收集 16 份慢性乙型肝炎患者的血清标本 HBV—DNA，扩增HBVEnhI基因，PCR产物测序后对HBV进行分型，并分析 HBV EnhI突变情况。结果 1O例 (62．5％)标本HBVEnhI基因PCR扩增阳性，测序标本经在线Genotyping比对后 ， 均属于B型，与参考序列 AF100309同源性最高，1O份标本的HBVEnhI区共发现 12个突变位点。结论 HBV EnhI基因存在多位点突变，此可能为促进病毒复制导致乙肝慢性化的机制。 关键词 ：乙型肝炎病毒；增强子 I；基因突变 中图分类号：R575．1 文献标志码 ：B 文章编号：1002—266X(2011)35-0037-02 乙型肝炎病毒 (HBV)是导致慢性肝炎、肝硬化 DNA提取液振荡混匀 5S，100℃恒温 10rain，12 和肝癌的重要病原，HBV感染易发展为持续性感染 000rpm离心5rain，上清备用 。 和慢性活动性感染。其基因组为不完全闭合环状双 1．2．2 目的基因测序及 比对 采用PCR反应 。在 链 DNA，基因组中的结构基因与调节基因相互重叠 0．5mlEP管中加入 HBVDNA提取液2 ，正、反 并受到不同调节序列的调控表达 。HBV调节序列 向引物各 1lxl，PCRMasterMix12．5 l，8．5 l双蒸 包括四个启动子 (CP，XP，SPI、sP11)和两个增强 水，总体积为25tzl。PCR反应条件 ：94℃预变性 5 子 (EnhI和EnhI1)…。结构基 因如 S抗原决定簇 rain；94oC变性 30S，58oC退火30S，72oC延伸30S， “ a”(aa124—147)内的突变 ’和前 C区出现 G1896A 共 35个循环 ；72oC再延伸 10rain，5IxlPCR扩增产 变异可导致免疫逃避 ，是乙肝慢性化 的重要原 因 物 1．5％琼脂糖凝胶 电泳 40min，紫外投射分析仪 之一。关于HBV基因组的转录与复制 中起重要作 上观察结果。将20 lPCR扩增产物送上海生工生 用的EnhI序列上的突变分析未见报道。2009年 8 物工程有限公司进行纯化测序 ，采用DNAMAN软件 月，我们对慢性 HBV感染患者血清 HBVEnhI区 对所测序列进行 比对 以分析基因突变。 DNA测序并分析相关的突变位点，进一步探讨 乙肝 2 结果 慢性化的机制。 2．1 PCR产物电泳结果 电泳结果显示 PCR阳性 1 材料与方法 标本均扩增出片段大小约576bp产物。大小与预 1．1 材料 参照2000年版中华医学会传染病与寄 期结果一致 ；对 10份PCR阳性产物进行测序 ，利用 生虫病学分会、肝病学分会联合修订的病毒性肝炎 Genebank中Genotyping软件 比对后，10份患者感染 防治方案为诊断标准。选取 16例慢性乙型肝炎患 HBV均属于 B型，与 Genebank中国上海地 区上传 者，男 11例，女5例 ；年龄(35±12．6)岁。抽取静脉 的参考序列AF100309同源性最高。 血分离血清，保存于 一2O℃冰箱，DNA提取液购 自 2．2 基因突变分析 采用 DNAMAN软件对 l0份 中山大学达安基因股份有限公司；HBVEnhI扩增 标本的DNA序列与Genebank中国上海地区上传 的 引物 ：正 向引物