干扰GINS2表达对HL60细胞增殖和凋亡的影响.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（３）：４１４６ 干扰ＧＩＮＳ２表达对ＨＬ６０细胞增殖和凋亡的影响 １ ２ １ １ １ １ １ １ 张　曦 　刘北忠 　高艳军 　黎　亮 　高远梅 　胡秀秀 　马鹏鹏 　钟　梁 （１重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室　重庆　４０００１６　２重庆医科大学附属永川医院中心实验室　重庆　４０２１６０） 摘要　目的：探讨靶向抑制ＧＩＮＳ２基因表达后对人早幼粒细胞白血病细胞株ＨＬ６０增殖和凋亡的 影响及其机制。方法：ＲＴＰＣＲ分别检测 ＧＩＮＳ２基因在三株白血病细胞 ＨＬ６０、Ｕ９３７、ＴＨＰ１的表 达。设计与合成针对ＧＩＮＳ２基因的干扰序列，稳定转染高表达该基因的ＨＬ６０细胞，荧光显微镜 观察绿色荧光蛋白的表达情况；ＲＴＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分别检测各组细胞转染后 ｍＲＮＡ和蛋白 质水平；ＭＴＴ法检细胞的增殖和凋亡情况；流式细胞术分析细胞的凋亡率；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测凋亡 相关蛋白的表达。结果：在三株白血病细胞株中，ＧＩＮＳ２的表达量由低到高依次是：ＴＨＰ１，Ｕ９３７， ＨＬ６０。干扰质粒转染ＨＬ６０细胞后，与阴性对照组及未处理组相比，干扰组ＧＩＮＳ２的ｍＲＮＡ和蛋 白质水平均显著降低，且细胞的增殖能力明显受抑。同时，凋亡相关蛋白Ｂａｘ表达水平显著增高 而Ｂｃｌ２显著降低。结论：干扰ＧＩＮＳ２基因表达后，其ｍＲＮＡ和蛋白质水平均显著降低，可通过上 调Ｂａｘ表达，下调Ｂｃｌ２表达来抑制ＨＬ６０细胞增殖并促进其凋亡。 关键词　ＧＩＮＳ２　细胞凋亡　ＨＬ６０细胞　Ｂａｘ　Ｂｃｌ２ 中图分类号　Ｑ２９１ 　　白血病是一组造血干细胞恶性克隆的血液病，急 　　为此，通过体外转染化学合成的ＧＩＮＳ２的靶向干 性早幼粒细胞 白血病 （ａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ， 扰质粒，检测稳定转染质粒后细胞的凋亡和增殖情况 ＡＰＬ）是白血病的一个亚型，其典型的遗传特点是定位 及研究其机制，探讨 ＧＩＮＳ２作为白血病的分子标志及 于１５号染色体上的早幼粒细胞基因（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ 诊疗靶点的可能性。 ｌｅｕｋｅｍｉａ，ＰＭＬ）和定位于１７号染色体上的维甲酸受体 １　材料与方法 基因（ｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒａｌｐｈａ，ＲＡＲ ）发生易位，形成 α 融合基因ＰＭＬＲＡＲ ，而后者产生的融合蛋白ＰＭＬ α １．１　材　料 ［１］ ＲＡＲ 在ＡＰＬ的发生发展中发挥着重要作用 。由 α １．１．１　细胞株　急性早幼粒细胞白血病细胞株ＨＬ６０ ［２］ Ｌａｎｅ等 研究发现，将ＰＭＬＲＡＲ 导入急性单核细胞 α （美国ＡＴＣＣ细胞库），急性单核细胞白血病细胞株 系来源的Ｕ９３７细胞中，融合蛋白可被中性白细胞弹性 ＴＨＰ１和Ｕ９３７由本室冻存。 蛋白酶（ＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌＥｌａｓｔａｓｅ，ＮＥ）切割成为 ６９ｋＤａ和 １．１．２　试剂　ＲＩＰＡ１６４０培养基和胎牛血清购自美国 ５３ｋＤａ的两种变异蛋白：即携带核定位信号的ＲＡＲ 和 ＴＭ α Ｇｉｂｃｏ公司，脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸＲｅａｇｅｎｔ购自美 缺失核定位信号的ＰＭＬ。前期利用酵母双杂交系统和 国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，Ｔｒｉｚｏｌ、逆转录试剂盒、ＰｒｅｍｉｘＴａｑ酶、 免疫共沉淀技术共同验证了ＧＩＮＳ２与变异蛋白ＰＭＬ存 限制性内切酶ＢａｍＨ 及Ｂｂｓ 、Ｔ４ＤＮＡ高效连接酶购