ZAP融合蛋白抑制HIV病毒模型构建及功能分析.pptVIP

HIV病毒是一种逆转录病毒 基因组RNA是病毒遗传信息的携带者 病毒RNA 也是翻译病毒蛋白的模板. 在HIV 复制过程中，病毒自身编码两种蛋白：Tat和Rev Tat 是一种RNA 结合蛋白， 能够特异性结合到HIV 病毒RNA 上的TAR (transactivation response element) 序列. 通过与P-TEFb (positive elongation factor b) 中的cyclin 亚基的相互作用，Tat 招募CDK9(cyclindependentkinase 9)完成对RNA 聚合酶Ⅱ C 化，使之完成从起始转录到转录延伸功能的转变，增强病毒各种基因的转录 Rev 是HIV 病毒自身编码的另一种辅助蛋白 可以特异性地结合到HIV 病毒RNA 上的RRE (Rev response element) 序列 在GTP 酶RAN、入核因子Importin-β和亮氨酸富集出核信号(NES) 的受体CRM1 等细胞因子的共同作用下，使未剪接或未完全剪接的RNA 出核进入细胞质，并可增强HIV RNA 的稳定性，促进RNA 的翻译. ZAP (zinc-finger antiviral protein)含有4 个CCCH 型的锌指结构，能够特异性抑制某些病毒的复制 ZAP 作用机理的研究结果表明，ZAP本身不具有RNA 酶的活性,同时它对HIV病毒抗性也不是很明显，这就说明它不能有效地结合到其RNA上。 一.融合蛋白载体的表达 我们把pcDNA4-ZAP-myc、pcDNA4-NZAP-myc 和pcDNA4-CZAP-myc（四种质粒）分别用于在哺乳类细胞中表达ZAP、NZAP 和CZAP 其中NZAP 代表ZAP 的N 端截短体CZAP 代表ZAP 的C 端截短体 通过特定的手段我们来表达出 ZAP-Tat,NZAP-Tat，ZAP-Rev,Tat-ZAP、Rev-ZAP、Tat-CZAP 和Rev-CZAP蛋白 其中，Tat 或Rev 位于融合蛋白N端的有Tat-ZAP、Tat-CZAP、Rev-ZAP、Rev-CZAP，Tat 或Rev 位于融合蛋白C 端的有ZAP-Tat、NZAP-Tat、ZAP-Rev 三.荧光素酶活性分析 为检测不同的融合蛋白对HIV 假病毒载体的影响，我们使用了双荧光素酶活性分析系统. 体系中HIV 假病毒载体转录出的mRNA 包含萤火虫荧光素酶基因编码序列，经翻译后表达的萤火虫荧光素酶活性可视为HIV 假病毒载体携带的基因表达量. 免疫荧光染色 因为ZAP 是一种核质穿梭蛋白，在稳态下定位在细胞质中,从而可以招募细胞质中的核酸外切酶复合体介mRNA 的降解.那么融合了Tat 和Rev 的ZAP 蛋白是否会产生定位上的变化呢? 为观察融合蛋白定位，我们将融合蛋白表达载pcDNA4-ZAP-Tat-myc 和pcDNA4-ZAP-Rev-myc 分别转染293 细胞. HIV 假病毒报告载体的改造 融合蛋白ZAP-Tat 对报告载体pHR’-CMVluc表达的荧光素酶活性有明显抑制作用 为了检测带有Tat 的融合蛋白对带有TAR 序列的mRNA 有何种影响，将含有Tat 序列的融合蛋白与报告载体pHR’-CMV-luc 和内参质粒pRL-TK 共转染293 细胞，48 h 后收集细胞检测荧光素酶活性 计算出抑制倍数(抑制倍数= 空质粒共转染组比值/ 功能蛋白共转染组比值)得出如下结果: 同样的方法我们来检测Tat的融合蛋白对报告载体pHR’- luc影响,方法同上 那么HIV RNA 的结合蛋白Rev 用于融合蛋白会有什么效果呢? 由于Rev 的结合位点是RRE 序列，故采用mRNA 序列中带有RRE 序列的报告载体pHR’-luc(SA-)和pHR’-RRE-luc. 由于报告载体pHR-luc转录出的RNA 也是带有RRE 序列的，只是发生剪接后RRE 序列才丢失，而ZAP 和Rev 都是核质穿梭蛋白，那么融合后的蛋白质极有可能入核作用于未发生剪切的RNA,所以同时使用报告载体PHR’-luc 作为对照来检测一下ZAP-Rev对PHR’-CMV-luc表达的荧光素酶的活性的影响 总结: ZAP 可以通过融合HIV RNA 结合蛋白Tat 或Rev 的方式抑制HIV 假病毒载体携带基因的表达. 虽然本报告中所观察到的抑制倍数只有5～6 倍，但至少证明了这种方法的可行性，这一方法可能成为一种新的抑制特定基因表达的手段. 另外, 经过改造,ZAP-Tat 和ZAP-Rev 对HIV 假病毒载体的抑制能力有可能进一步提高. ZAP-Tat 或ZAP-Rev 对HIV 活病毒的抑制活性.