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中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2012, 3410: 1023?1029 http:// 探索?发现 B 荧光互补与光能量共振转移检测 类 G PAC1 蛋白偶联受体 二聚化 郭晓令 余榕捷* 钟佳萍 李 梅 曾智星 刘晓飞 暨南大学生命科学技术学院生物医药研究院, 广州 510632 摘要G蛋白偶联受体G-protein couple receptors, GPCRs是最大的超家族膜受体, 其中它 的B家族成员垂体腺苷酸环化酶激活肽1PAC1是垂体腺苷酸环化酶激动多肽PACAP的特异受 体, 介导PACAP神经保护等功能, 是神经系统疾病药物开发的重要靶点之一。二聚化或寡聚化是 GPCRs普遍存在的现象, 但是目前尚没有关于PAC1形成同源二聚体或寡聚体的报道。为了验证 PAC1也能进行同源二聚化, 该文采用生物发光能量转移bioluminescence resonance energy transfer, BRET方法进行检测, 结果显示不同浓度梯度共转染中国仓鼠卵巢细胞Chinese hamster ovary, CHO的PAC1-Rluc与PAC1-EYFP重组载体, 在底物腔肠素hcoelenterazine h作用下呈现明显的 BRET信号。双分子荧光互补BiFC检测显示, 带有EYFP N端基因标记的PAC1与带有EYFP C端基 因标记的PAC1共转染CHO细胞, 能呈现完整的EYFP荧光信号。同时, Western blot检测也显示, 高 表达PAC1的细胞中可检测到PAC1二聚体的大分子。因此, PAC1是能够进行正常同源二聚化的, 这 个发现将为后续神经损伤药物的开发奠定全新的理论基础, 同时也为其他GPCRs同源二聚化的研 究起到启发和借鉴作用。 关键词GPCRs; PAC1; 同源二聚化 [6-8] G 蛋 白 偶 联 受 体G-protein couple receptors, GP- 学 作 用 的 , 但 是 很 多 药 物 都 是 针 对 单 个G 蛋 白 偶 [1] CRs , , 是 迄 今 为 止 发 现 的 最 大 的 超 家 族 膜 受 体 其 成 联 受 体 作 用 而 设 计 的 很 少 是 针 对 它 的 多 聚 化、 寡 [9] 员 有 上 千 种, 被 分 为5 个 亚 家 族: A 族?? 视 紫 红 质 聚 化 或 二 聚 化 来 设 计 给 药 的 。 已 经 有 很 多 研 究 通 , B , C 样 受 体 家 族 族?? 分 泌 素 样 受 体 家 族 族?? 过 不 同 的 生 物 物 理、 生 物 化 学 来 探 索 该 类 受 体 的 寡 谷 氨 酸 盐 样 受 体 家 族, D 族??adhesion 家 族, E 聚 化 或 多 聚 化, 但 大 多 数 是 针 对GPCRs 的A 家 族 成 frizzkd/Taste2 GPCRs , B PAC1 族?? 家 族。 对 大 量 的 刺 激 包 员 的 很 少 是 针 对 家 族 成 员 的。 主 要 分 布 在 括 生 物 胺、 多 肽、 神 经 递 质、 气 体、 离 子、 脂 类、 中枢神经系统、 周围神经系统及神经内分泌系统如 , , , 核酸、光 甚至蛋白酶都能产生应激反应 当受到相 脑、 丘 脑、 耳 蜗、 视 网 膜、 肾 上 腺 及 胰 岛 等 主 要 应 刺 激 时, 信 号 通 过 质 膜 被 传 到 与 它 偶 联 的G 蛋 白 介 导 了PACAP 的 神 经 递 质、 神 经 调 质、 神 经 保 护、 [2-3] [10-11] , GPCRs , 酶 从 而 启 动 相 应 的 信 号 通 路 。 具 有 共 同 抗 神 经 损 伤 及 调 控 神 经 再 生 的 功 能 是 开 发 治 的 结 构 特 征, 由 七 个α螺 旋含25-35个 氨 基 酸跨 膜 结 疗 帕 金 森 病、 老 年 痴 呆 症、 手 足 舞 蹈 症 等 神 经 损 伤 [4] N C PAC1 构 域、 端 胞 外 域、 端 胞 内 域 三 部 分 组 成 。 尽 管 药 物 的 首 选 靶 受 体。 同 源 二 聚 化 机 理 的 阐 明 它 们 有 相 似 的 结 构, 但 是 它 们 却 各 自 参 与 不 同 的 生 [5] 收稿日期: 2012-06-08接受日期: 2012-07-23 , 理和病理过程的调控 。 它们的重要作用体现在 在 国 家 自 然 科 学 基 金 青 年 基 金No和 广 东 省 自 然 科 学 基 临 床 实 践 中 大 约40%~50% 的 药 物 是 通 过 直