实验九长春花愈伤组织的诱导培养及吲哚生物碱的提取测定.pptVIP

实验九 长春花愈伤组织的诱导培养及吲哚生物碱的提取测定（1） 长春花－－生产抗癌生物碱的药用植物 【实验原理】 在无菌条件下，对离体的植物组织（器官或细胞）进行人工培养，可以使已经停止分化生长的细胞重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。 【实验目的】 掌握诱导和继代愈伤组织的方法，以及提取和测定生物碱的方法。 【实验材料】 长春花植株（新鲜幼嫩的茎、叶、芽或根）。 【实验内容与步骤】 长春花愈伤组织的诱导及继代培养 (1) 培养基的配制： 按附录所示MS培养基配方，已预先配制好大量元素、微量元素、铁盐和有机溶剂的母液。根据配制的体积来计算用量，同时加入不同配比的激素制成诱导和继代培养基（参照表1），并调pH至5.8--6.2，分装于50mL锥形瓶中，每瓶含有培养基25mL，高压灭菌20 min，静置冷却备用。 【实验要求】 1.每个实验组要求配8瓶培养基，每瓶25mL. 4瓶的MS愈伤培养基 （2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 4瓶的MS继代培养基 2.配培养基时注意在加入琼脂粉前将PH调到5.8--6.2 ，过酸培养基不凝，过碱培养基太硬，不利于接种。调pH时用pH试纸（三盒），从范围大的到范围小的调。 3.在超净台中，无菌操作。 (2) 愈伤组织的诱导 剪取长春花新鲜幼嫩的叶，用自来水冲洗30 min，再用蒸馏水反复冲洗，然后用10%的安替福民（次氯酸纳）浸泡5 min消毒备用。 在无菌条件下，用手术刀将消毒的植物材料切成0.5cm长宽的小块，再将小块的材料放入无菌水中反复冲洗，然后转接至培养基上（每瓶接种3~4块），26~28℃光培养。 (3) 愈伤组织的继代培养： 30天左右，将诱导而来的愈伤组织从外植体上剥离，转至新的培养基上继代培养，以后每20天左右继代一次，接种0.5~1.0g/瓶，培养条件同上。 (4) 愈伤组织生长的测定 将长春花愈伤组织从培养基上剥离，称鲜重（取3瓶组织鲜重平均值）。 下次实验的内容： 2. 吲哚总碱的分离提取 3. 阿玛碱和长春质碱的定性定量分析 * * 植物生物学实验-植物生理部分 Initiates cell division when present with auxin. Causes differentiation in callus. High CK? shoots; 表一 诱导和继代培养基的配法 1mL 0.5 mL 6-苄基腺嘌呤（6-BA）1g/L 1mL 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 1g/L 2 mL 0.5 mL 萘乙酸（NAA）1g/L 30g 30g 蔗糖 7.2g 7.2g 琼脂 10 mL 10 mL 有机溶剂 100× 10 mL 10 mL 铁盐 100× 1 mL 1 mL 微量元素Ⅱ 1000× 5 mL 5 mL 微量元素Ⅰ 200× 50 mL 50 mL 大量元素20× 配1L愈伤继代培养基 配1L诱导愈伤培养基 母液名称及浓度 *