OCIL shRNA表达载体的构建及其对成骨细胞RANKL／OPG基因表达的调节.pdfVIP

1226 TianjinMedJ，Dec2012，Vol40No12 doi：10．3969／j．issn．0253—9896．2012．12．014 OCILshRNA表达载体的构建及其对成骨细胞 RANKL／OPG基因表达的调节 王 君 郑 纺 王宝利 摘要 目的：探讨成骨细胞中破骨细胞分化抑制因子(OCIL)基因敲减后护骨素(OPG)和核因子KB受体活化 因子配基 (RANKL)mRNA的表达水平及其对破骨细胞分化的影响。方法 ：构建OCIL特异性 shRNA表达载体并 转染至细胞．分为 pRNAT—N1组、pRNAT—N2组、pRNAT—N3组和阴性对照转染组。考察与阴性对照转染组比较 ， 各组对 OCILmRNA水平的抑制率。将对 OCILmRNA干扰效果最佳的 shRNA表达载体 (pRNAT—N1组)和对照 载体pRNAT—U6．1／Neo／CTL(control组)分别瞬时转染 UMR106细胞 ，考察 2组 RANKL和 OPG表达水平。各转染 组条件培养基干预骨髓细胞后，观察PBS+controlshRNA(vehicle组)、PTH+controlshRNA(PTH组)及 PTH+OCIL shRNA(shRNA组)破骨细胞样细胞(OLC)数量 。结果：(1)与阴性对照转染组 比较 ，pRNAT—N1、pRNAT—N2、 pRNAT—N3对 OCILmRNA水平抑制率分别为 64％、28％和 59％。(2)pRNAT—N1转染 UMR106成骨细胞后 ， RANKLmRNA表达水平 明显升高，而 OPGmRNA表达水平 明显降低 ，转染后 24hRANKL：OPG比值较 control组 升高 5．1倍 。(3)vehicle组、PTH组及 shRNA组 OLC数分别为(1．83±0．75)个／孑L、(49．67_+6．77)个 ／孔及 (65．50± 7．34)个 ／孔，差异有统计学意义(P0．05)。结论：RANKL／OPG系统参与了OCIL对破骨细胞分化的调节作用。 关键词 成骨细胞 破骨细胞 骨保护素 核因子-(B受体活化因子 RNA，信使 基因表达 ConstructionofOCILshRNAExpressionVectorandltsEffectsonRANKL／OPG ExpressioninOsteoblasts WANGJun．ZHENGFang．WANGBaoli InstituteofEndocrinology／MetabolicD eeHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianfin300070,China Abstract Objective：Toinvestigatetheosteoclastinhibitorylectin(OCIL)shRNAexpressioninosteoblasts，andits effectsonRANKL／OPGexpressionandonosteoclastogenesis．Methods：SmallhairpinRNA (shRNA)codingsequences targetingratOCILmRNA atthreedifferentsitesweredesigned．synthesizedandcloned intopRNAT—U6．1／Neovector． TheconstructsweretransfectedintoUMR106celllinewithlipofectamine2000．Aftertransfectionfor12hand24h．the expressionlevelofOCILmRNA inthecellswasdeterminedbyreal—timequantitativeRT—PCR．Theexpressionlevelsof RANKL and OPG werealso stu