紫花苜蓿MsZIP基因超表达载体的构建及转基因苜蓿检测.pdfVIP

182— 189 草 业 学 报 第 21卷 第 6期 2012年 12月 ACTA PRATACULTURAE SINICA V01．21。No．6 紫花苜蓿MsZIP基因超表达载体的 构建及转基因苜蓿检测 李燕 ，孙彦 ，杨青川¨，康俊梅 ，张铁军 ，房锋。 (1．中国农业科学 院北京畜牧兽 医研究所 ，北京 100193；2．中国农业大学动物科技学院，北京 100191 3．中国农业科学 院植物保护研究所 ，北京 100193) 摘要 ：根据 已经克隆得到的MsZIP基 因 (GenBank序列号：HQ911778)，扩增编码 区 cDNA，构建植物超表达载体 PBI—MsZIP。酶切鉴定表明，目的基因已经正确的插入到载体中，超表达载体构建成功。采用 CaC1。冻融法将其转 入农杆菌菌株 中，然后采用农杆菌介导的方法 ，转化紫花苜蓿，共得到 11株抗性苗 ，对其 中的4株进行卡那霉素基 因PCR检测 ，均得到了 目的条带 。同时对这 4株抗性苗进行 目的基因的 RT—PCR检测 ，均得到 了 目的条带 。说 明 MsZIP基因已经成功在苜蓿中超表达。为 了进一步验证该基 因的功能 ，分别用 200mmol／LNaCI和 252／mol／L PEG-6000处理转基 因苜蓿，3d后进行生理指标 的测定 。结果表 明，MsZIP基 因在苜蓿 中超表达可 以提高苜蓿的 耐盐性和耐旱性 。 关键词：紫花苜蓿；MsZIP基因；超表达载体 ；苜蓿转化；转基因苜蓿检测 中图分类号 ：$816；$541’。．103；Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：1004—5759(2012)06—0182—08 随着生物技术 的发展，对于植物的研究 已经深入到分子水平 ，侧重于从分子角度 阐明植物各种生理反应机 理 ，分子机制 ，以及基因水平 的调控。在培育植物新品种 ，提高植物抗逆性方面 ，植物转基因技术已经成为近年来 研究的重点内容之一。转基 因育种也成为 了苜蓿新品种培育的一项重要手段_】]。在 目前的植物转基因育种 中， 主要采用的技术有农杆菌介导法 ，微注射法，电击法和基 因枪法 。在紫花苜蓿 (Medicagosativa)的育种工作 中， 农杆菌介导法成为主要的方法，1986年，首例农杆菌介导的苜蓿转化获得成功，之后又建立了紫花苜蓿的遗传转 化体系l2l3J，苜蓿转基因工作获得 了很大的进展 。在苜蓿中，已经有很多抗逆相关的基因被分离，Brouwer等-l4将 烟草 (Nicotianatabacum)的Mn—SODcDNA导人苜蓿中，发现转基 因植物 SOD活性增强 ，2轮的田问试验鉴定 表明，转基因苜蓿 的抗寒性 明显提高。2000年 Winicov和 Bastoldl5将 A z基因导入苜蓿中，增强 了盐诱导的 MsPRP2基 因的表达 ，在植株的生长过程中其耐盐性得到了提高，并且生长速度加快。Munnik等_6]从紫花苜蓿 中分离出了MAPK(mitogen-activatedproteinkinase)路径第一个关键酶基 因SIMK，序列分析结果表 明，它与 拟南芥 (Arabidopsisthaliana)中的MAPK基 因具有极大的相似性 ，盐胁迫下其体内的表达水平上调 。2011年 ， 江藤等 对蒺藜苜蓿 (Medicagotruncatula)全基因组 WRKY转录因子进行 了分析，发现蒺藜苜蓿 中含有 28个 WRKY基因，同时将这些基因与水稻 (Oryzasativa)的WRKY基 因进行 了比较分析 ，为研究苜蓿的WRKY转 录因子提供了重要的理论依据。刘晓静等[8]将抗冻基因CBF2构建表达载体并转化和 田苜蓿 ，成功得到和 田苜 蓿的愈伤组织。燕丽萍等 采用分子生物学检测和不同浓度的NaC1对转BADH基因苜蓿T1代 2个株系进行 遗传稳定性和抗盐性研究，结果表 明，转入的BADH 基因可 以稳定遗传 ，转基因苜蓿耐盐性明显高于对照。蒋 世翠等l|10]将 aFGF基因构建表达载体并转化紫花苜蓿 ，成功得到 了表达 aFGF基 因的苜蓿，为苜蓿作为植物生 物反应器奠定了理论基础 。