转Bt基因植物表达产物Cry1Ab蛋白的制备纯化方法研究.pdfVIP

第 33卷 分析化学 ( FENX I HUAXU E) 　研究报告 第 7期 　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　 2005年 7 月 Ch ine se Jou rnal of A nalytical Chem istry 927 ～930 转 Bt基因植物表达产物 Cry1Ab蛋白的制备纯化方法研究 邬建敏 　奚凤娜 叶庆富 (浙江大学化学系 ,杭州 3 10027) (浙江大学原子核农业科学研究所 ,杭州 3 10029) 摘 　要 　以转 B t基因水稻为试材 ,研究其表达产物 Cry1Ab 蛋白的提取 、分离及纯化的方法 。实验结果表明 , D EA E纤维素填料对 B t 蛋白有较好捕获效果 。根据生物信息学方法预测了目标蛋白和主要共存蛋白的等电 点和疏水性差异 。合理地选择了阴离子交换色谱与疏水作用色谱组合方法 。提取液经 D EA ESep hadex A 50 柱层析及 PhenylSepharo se Fast F low 疏水层析分离后 , 目标蛋白得到了显著的纯化 。考察了疏水层析中用不 同洗脱液洗脱 Cry1Ab 蛋白对活性回收率和纯度的影响 ,结果表明: 以 0. 25 mol/L KSCN 作洗脱液对活性影响 最小 , H IC一步纯化倍数可达 8倍 ,总纯化倍数达 100倍 。 关键词 　转 B t基因水稻 , Cry1Ab 蛋白,疏水层析 ,纯化 1　引　　言 ( ) [ 1 ] Cry1A b 蛋白是一种源于苏云金杆菌 bacillu s thu ringien sis 的 B t基因表达的毒蛋白 。目前已经 实现了将 B t基因导入植物 ,培育成高抗虫的转 B t基因植物 。然而转基因作物引起的食品安全性和环 境安全性引起人们广泛的关注 [ 2 ～3 ] 。目前国际上在评价转 B t基因植物表达的杀虫蛋白的生物安全性 和环境行为时 ,往往采用该基因在微生物 E. coil. 内的表达产物 。但绝大多数转 B t基因植物导入的是 截取或修饰后的基因 ,微生物表达的杀虫蛋白的实验结果并不能完全代表转 B t基因植物表达的蛋白特 性 。因此 ,从转 B t基因植物中分离纯化 B t毒蛋白显得尤为重要 。但是 B t毒蛋白在植物总可溶性蛋白 中的比例很小 ,分离难度较大 。本实验以转 cry ⅠA b基因水稻为试材 [ 4 ] ,采用生物信息学方法对 目标蛋 白与主要共存蛋白的有关结构特性进行了预测 ,选择了离子交换和疏水作用多重色谱组合技术 ,较好地 解决了低丰度 目标蛋白的高效分离和纯化问题 ,建立了一种从转 B t基因植物中纯化 Cry1A b 毒蛋白的 有效方法 ,为系统研究该蛋白生物活性和一级结构分析奠定了基础 。采用生物信息学方法预测蛋白结 构并在此基础上建立合理的蛋白纯化策略 ,也为蛋白质的分离纯化研究提供了新的途径 。 2　实验部分 2. 1　仪器与试剂 ( ) ( ) 高压恒流泵 P100 , 大连依利特有限公司 ;酶标仪 SPECTRA MAX 100 , 美国 ; UV 120 1紫外可见 ( ) ( ) ( ) ( 分光光度计 日本岛津公司 ; 蠕动泵 D 100B ,上海 、馏分收集器 B SZ16