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高分辨率熔解 HRM 的应用前景 高分辨率熔解（High-resolution melting，简称 HRM ）分析是一门新兴的技术。它仅仅通过PCR 之后的熔解曲线分析，就能检测 PCR 片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分 型等多个方面。凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法正在迅速普及。 其实双链 DNA 的熔解分析可追溯到上世纪六 DNA 链的解链温度。但是这个差异极小，只有零 十年代，当时是通过紫外吸收来监测的。分析需要 点几摄氏度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法 几微克的 DNA，而样品以 0.1-1.0°C/分钟的速率缓 检测的。 慢加热，常常要花上几个小时才能完成。后来， 那么什么样的分辨率才是高分辨率呢？根据 LightCycler 定量 PCR 仪的出现，让荧光熔解分析 仪器现有的功能测试，在熔解操作时每摄氏度至少 变得流行。样品量因毛细管而缩减至纳克级，且熔 要获得 10 个数据点，这是对仪器的最低要求。此 解速率更快，达 0.1-1.0°C/秒，这样熔解时间缩短 外，温度均一性也同样重要。如果两孔之间温度相 至几分钟。当时使用的染料是 SYBR® Green I 。 差 0.1°C ，就很可能导致最终的熔解温度相差 然而，这种熔解分析只能区分在片段大小和 0.1°C，这样就无法保证 HRM 分析结果的准确性。 GC 含量上差别较显著的 DNA 序列，比如检查 大多数常规定量 PCR 仪的孔间温度差在 PCR 扩增产物中是否存在引物二聚体及其他非特 0.3-0.5°C，这也决定了它们无法胜任 HRM。 异性的扩增。如果要区分 SNP，分辨率还不够。 目前市场上有多个厂家提供 HRM 分析的仪 为什么呢？这里有必要先介绍一下饱和染料和非 器，包括 Idaho Technology、Corbett （QIAGEN ）、 饱和染料。SYBR Green I 就属于非饱和性染料， Roche 等，有些是专供 HRM 的仪器，有些则是附 由于它对 PCR 的抑制作用，在实验中的使用浓度 带 HRM 功能的定量 PCR 仪。HRM 的发明者—美 很低，远未将 DNA 双螺旋结构中的小沟饱和。这 国犹他大学医学院的Wittwer 实验室曾评估了市场 样，DNA 双链高温变性时，单链部分的荧光染料 上多台仪器在基因分型和突变扫描上的性能 1。他 分子发生重排，荧光染料分子重新结合到双链 们发现，对于大部分仪器的准确基因分型来说，主 DNA 的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此 要限制在于平板上的空间温度差异（Tm 的标准偏 出现假阴性，特异性下降。 差为 0.020-0.264°C ）。其它差异如数据密度、信 于是，饱和染料问世了。为什么称为饱和染料 噪比和熔解速率，也会影响杂合体的扫描。经过比 呢？因为它们即便在饱和浓度（荧光最大）下，也 较发现，空气加热型仪器以及样品温度单独控制的