变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A的表达、纯化与鉴定.pdfVIP

2012年 4月 首 都 医 科 大 学 学 报 Apr．2012 第 33卷 第 2期 JournalofCapitalMedicalUniversity Vol_33 No．2 [doi：10．3969／j．issn．1006-7795．2012．02．019] ·基 础 研 究 · 变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶 A的表达、纯化与鉴定 武文琦 ， 丛旭珍 殷爱红 胡 家 翟方丽 李慎涛 (1．首都医科大学基础医学院生物化学与分子生物学和免疫学系 ，北京 100069；2．首都医科大学医学实验与测试中心 北京 100069；3．青岛阜外心血管病医院检验科，青岛266034) 【摘要】 目的 在大肠杆菌中高效表达变异链球菌核糖-5一磷酸异构酶A(ribose5-phosphateisomeraseA，rpiA)，并对表达产物进 行纯化和鉴定。方法 根据GenBank中变异链球菌UA159株基因组rpiA的DNA编码序列，设计 PCR引物，扩增变异链球菌核 糖．5-磷酸异构酶A的DNA编码序列，将其克隆至pGEX-6p一1载体中，构建重组质粒，将测序正确的重组质粒转化人大肠杆菌 BI21(DE3)中，用异丙基一p—D一硫代吡喃半乳糖苷 (isopropyl3-D-1--thiogalactopyranoside，IPTG)诱导表达 ；对培养温度 、IPTG 用量 、诱导时间等条件进行了优化；用亲和层析、离子交换层析纯化 目标蛋白；用SDS—PAGE和质谱对 目标蛋白进行鉴定。结果 变异链球菌核糖一5一磷酸异构酶A在大肠杆菌中高效、可溶性表达，经质谱鉴定及 SDS—PAGE分析，表达产物为变异链球菌核糖． 5·磷酸异构酶A蛋白。经过纯化 ，得到纯度高达95％的变异链球菌核糖_5-磷酸异构酶A。结论 成功地在大肠杆菌中高效表达 了变异链球菌核糖一5．磷酸异构酶A蛋白，并建立了纯化工艺，得到高纯度的重组蛋白，为进一步研究变异链球菌属核糖．5一磷酸 异构酶蛋白的生物学活性及功能奠定了基础。 【关键词】 变异链球菌；核糖_5一磷酸异构酶A；融合蛋白；原核表达；蛋白纯化 【中图分类号】 R446．1 Expression，purification and characterization ofribose5-phosphateisomeraseA from Streptococcusmutans WUWen—qi ，CONGXu—zhen ，YIN Ai-hong ，HU Jia ，ZHAIFang—li，LIShen—tao (1．DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology，Departmentofimmunology，SchoolofBasicMedicalSciences，CapitalMedwal University，Be~iing100069，China；2．MedicalExperimentandTestCenter，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China；3． DepartmentofClinicalLaboratory，QingdaoFuwaiHospital，Qingdao266034，China) 【Abstract】 Objective Toexpress，purifyandcharacterizetheribose5-phosphateisomeraseA(rpiA)fromStreptococcusmutans． M ethods A DNA fragmentencodingS．mutansribose5-phosphateisomerase A wasamplified by PCR usingthegenomicDNA of StreptococcusmutansUA159asatemplate．ThePCR productwasclonedintovectorpGEX-rp-1．TheconstructcarryingthecodingDNA sequenceofrpiAfusedwithGSTwastransformedintoE．coliBI21(DE3)，andthefusionproteinwasexpress