细胞总RNA的提取操作步骤.docVIP

细胞总RNA的提取操作步骤 准备 1、??物品：Trizol、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、75%灭酶异醇、冷PBS、1.5ml灭酶EP管、灭酶枪头、一次性手套、EP管架、吸管 2、??打开冷冻离心机4预冷 二、操作步骤： 将Trizol、氯仿、冷PBS、EP管、灭酶枪头、一次性手套、EP管架、吸管等物品带入细胞室。 1、??取出EP管、做好标记 2、??取出细胞、收集上清保存备用 3、??用冷PBS冲洗细胞两次 4、??加入 1ml?Trizol?（24孔板每孔加0.5ml即可），调小刻度用移液器吹打细胞至液体澄清（生化：摇动混匀后室温孵育10min） 5、??将裂解液转移至1.5ml灭酶EP管中，用黄枪头加入氯仿0.2ml（1/5?Trizol体积），用手剧烈震摇15秒，置室温5min（生化：3min??dxyer：15min），分层 6、??4、12000g（12300rcf）离心15min，可见分层。 7、??用黄枪头小心收集上层水相约0.5ml置于另一1.5ml灭酶EP管中（确保不要吸入中间层和有机相）。 8、??各管分别加入0.5ml 异丙醇（等体积），用力摇匀，置室温10min。（提前将异丙醇4预冷，或混匀后置-20?60min，提取效果更好） 9、??4、 12000g离心10min，可见RNA沉淀。 10、倒弃上清，用滤纸吸干管口余液，加入预冷的75%灭酶异醇1ml，用指轻弹管壁使 RNA沉淀飘起?洗涤。11、4、7500g（7700rcf）离心5min，生化为10min，（亦有dxyer用 12000g），沉淀即为总RNA。12、弃上清，真空干燥约4min或空气中干燥5~10min，加入20μl（30μl）DEPC 水。56水浴小于10min助溶，取少量测OD值，其余-70保存备 RNA制备的问题与解答 1、塑料制品、玻璃和金属物品的处理 (a)塑料制品：尽可能使用无菌，一次性塑料制品。已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理方法如下： (1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。 (2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 (3)在通风柜中室温处理过夜。 (4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。 (5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 (b)玻璃和金属物品 250°C烘烤3小时以上。2、RNase 是RNA制备的杀手 ??RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取 RNase-free的物品时必须戴手套。3、采用什么方式纯化总RNA？ 答：我们提供多种RNA纯化方式，根据您对RNA纯化技术的熟悉程度，选用不同的纯化手段。从产品使用效果看，基于TriBlue的一步法分离总RNA试剂盒（K311,K321系列）无论是新手还熟手都可以得到比较理想的结果。如果您对苯酚过敏，出于对环境的保护，您可以选用整个分离流程都不使用苯酚的试剂盒（K361系列）。从产品形式上，我们的总RNA分离分醇沉淀离心式和离心吸附柱方式两种。沉淀方式总的产量比较高，纯化规模机动，但是纯度不及吸附柱方式；吸附柱方式操作比较简单，纯度高，受吸附容量的影响，产量收到影响。4、什么时候需要分离mRNA? 答：常规RT-PCR鉴定基因表达水平的，一般都可以采用总RNA作为RT-PCR 的模板，但是做cDNA文库，克隆丰度极低的基因，大多数DD-PCR， 削减杂交等需要纯化的mRNA。一般用oligo (dT)-cellulose或在磁珠上偶连oligo (dT)，从组织或总RNA种直接分离mRNA。5、如何判定分离的总RNA的纯度？ 答：需要从两个方面着手，缺一不可，特别是新手（1）测定OD260/OD280的比值，测定时，RNA需要用10mM Tris-HCl,pH7.5稀释。理想的RNA, OD260/280在1.9-2.1之间。比值如果过低，可能有蛋白质污染，过高RNA可能已发生降解。（2）琼脂糖变性电泳观察rRNA的完整