aFGF植物表达载体构建及转化紫花苜蓿的初步研究.pdfVIP

18O一 186 草 业 学 报 第 2O卷 第 4期 2011年 8月 ACTA PRATACULTURAE SINICA V0L2O，No．4 aFGF植物表达载体构建及转化 紫花苜蓿的初步研究 蒋世翠 ，王义 ，孙春玉 ，王艳芳 ，李校垄 ，张美萍 (1．吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118；2．国家教育部生物反应器工程中心 ，吉林 长春 130118) 摘要 ：主要将aFGF基 因按照植物偏爱的密码子进行基因优化 ，同时加上信号肽 、6一组氨酸标签及凝血酶切割因子 ， 合成全基 因，再将基因插入到改造的TfI4AB质粒中，将 aFGF基 因和质粒上的增强子、启动子、Q序列及 ployA加 尾序列双酶切，命名为T~I4AB-aF，将 TfI4AB-aF插入到pBI121载体中命名为 pBI121一TfI4AB-aF。利用三亲融合 法将 pBI121一TfI4AB-aF转入到农杆菌菌株 LBA4404中，转化苜蓿 。转基 因苗用卡那霉素进行筛选 ；并对抗性苗进 行 PCR、RT—PCR、WesternBlot检测 。结果表 明，aFGF在苜蓿中得到表达 。为苜蓿作为植物生物反应器奠定理 论 基础 。 关键词 ：aFGF；植物生物反应器 ；紫花苜蓿 中图分类号：$541。。．1；Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1004—5759(2011)04—0180—07 植物作为天然药物的来源已有很长的历史。随着现代分子生物学的发展，许多外源蛋 白在植物中得到 了表 达 ，这些外源蛋白包括血浆蛋 白、酶、生长因子、疫苗和重组抗体等L1]。用植物表达外源蛋 白有许多优势，例如能 够正确进行折叠和翻译后的修饰 ，无动物细胞的病毒和病原菌对人造成伤害的危险等 ，并且操作简单 ，成本低廉 ， 易于大规模生产 J。 紫花苜蓿 (Medicagosativa)是多年生豆科苜蓿属 ，草本植物 ，三出复叶，总状花序腋生 ，荚果_5j。是世界公 认 的优 良牧草，在世界各国都大面积种植。苜蓿 的茎 、叶中含有包括矿物营养素在 内的5O多种营养物质及未知 生长因子，其营养成分 比其他植物丰富许多，被称为万能植物。苜蓿 的主要成分是叶蛋 白，其在苜蓿种中的含量 比较大 ]。苜蓿是一种世界范围广泛种植的饲料作物 ]，在实验室中又是研究植物发育的模式植物。对其进行 遗传转化 ，不论在理论上还是在应用上均具价值 。苜蓿作为植物生物反应器具有安全 、价廉 ；多数可直接饲用和 食用 ；易于收集 、纯化等优点 ]。DusSantos等 。。将 口蹄疫病毒 (FMDV)的VP1蛋白的编码基 因整合到苜蓿基 因组中并使其在苜蓿体内表达 ，老鼠试验结果表明，其体 内产生了保护性抗体，从而获得对 口蹄疫的免疫能力，这 是用转基因牧草作为口服疫苗使动物产生系统免疫反应的首次报道。 aFGF是人的酸性成纤维细胞生长因子 由154个氨基酸残基组成 ，分子量为 16kD。研究表 明，aFGF有着 广泛的生物学活性，它能促进神经再生，对神经元具有 营养支持作用 ，在 中枢神经系统创伤修复 中起重要作用， 在血管生成 、组织创伤修复等方面亦具有重要的作用_】 ]。 利用植物生物反应器表达外源蛋白虽然已取得 了一定的进展 ，但外源基 因在植物 中的表达水平很低 引。采 用以下几种方法对 目的基 因aFGF及植物表达载体进行改造 ，以期构建高效 的aFGF植物表达载体。首先 ，采 用植物偏好的密码子重新合成全长 的aFGF，对于翻译 的顺利起始和进行具有极为重要 的意义 ¨1。同时，基 因 中加入 6一组氨酸标签以及凝血酶切割因子，利于 aFGF的提取纯化。将 目的基 因插入到改造后 的TQAB中，加 入促进作用的表达调控元件 ：Koza序列，Q增强子序列，ployA加尾信号等_】 ，将 目的基因克隆到植物表达载 体 ，再转到农杆菌LBA4404中。最后转化紫花苜蓿 ，对转基因紫花苜蓿进行抗性筛选及检测 ，得到含有 目的基 因 收稿 日期 ：2010—05—30；改 回日期 ：2010—0705 基金项 目：十一五 “863”计划生物反应器重大专项(No．2007AA100503)，吉林