脂质对猪未成熟卵母细胞超低温保存效果的影响.pdfVIP

江苏农业科学 2008年第6期 脂质对猪未成熟卵母细胞超低温保存效果的影响 张 斌 ，武彩红 ，芮 荣 ，戴建军 (1．江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏泰州 225300；2．南京农业大学动物医学院，江苏南京210095； 3．上海农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106) 摘要：对猪卵母细胞进行直接冷冻 ，或冷冻前进行细胞松弛素B处理或细胞松弛素B和离心极化共处理。结果表明，各冷冻组在 解冻后均获得了较高的形态正常率，但冻后FDA染色存活率均显著低于对照组，分别为56．8％、45．7％和49．0％，对照组为95．4％(P 0．05)。冻后各组体外成熟率分别为42．6％、30．4％和27．O％，均存在显著差异(P0．05)，并显著低于对照组卵母细胞体外成熟率 (73．9％，P0．05)。仅直接冷冻后卵母细胞获得了7．8％的体外受精卵裂胚，也显著低于对照组的53．3％(P0．05)。在此基础上， 随机挑选胞质均匀、形态正常的新鲜卵母细胞和直接冷冻 一解冻后卵母细胞制备透射电镜样本，观察结果表明，冷冻后卵母细胞内脂 滴仅见均质状 ，而未见不均质脂滴。说明脂滴的变化可能是影响卵母细胞发育能力的原因之一。 关键词：猪；卵母细胞；脂质 ；超低温 中图分类号：Q492．5 文献标志码-A 文章编号：1002—1302(2008)06—0190—03 自20世纪8O年代人们开始对生殖细胞进行冷冻生物学 液。装管后立即投入 一196oC液氮内冷冻保存。解冻时，将 研究以来，许多哺乳动物卵母细胞冷冻保存已经获得了相当 OPS管从液氮取出直接置于37℃的0．5mol／L蔗糖溶液中， 成功，来 自于超低温保存卵母细胞的体外生产胚胎经移植已 回收卵母细胞，平衡 5min，然后将卵母细胞再于0．25mol／L 获得后代。然而，猪卵母细胞超低温保存仍处于摸索阶段，许 蔗糖溶液中平衡5min，经TCM199培养液洗2～3次后备用。 多学者将猪卵母细胞不耐受低温的主要原因归结于较高的脂 1．3 冷冻效果评价 质含量 -23。Nagashima等 报道，移除猪卯母细胞内脂质可 解冻卵母细胞于光镜下作形态学鉴定，并以二乙酸荧光 提高其冷冻耐受性，证实了脂质可增加卵母细胞的冷冻敏感 素(FDA)染色鉴定卯母细胞存活情况 。未成熟卵母细胞 性。然而，卵母细胞内的脂质是其受精后胚胎发育的能量和 经培养后，卵丘细胞扩散后直径为卵母细胞直径的5倍以上 物质基础 ，移除卵母细胞 内脂质显然是不可取的。因此， 或出现第一极体 (pbI)者判为成熟卵母细胞。卵母细胞成 脂质对猪卵母细胞超低温保存效果的影响值得讨论。 熟后的体外受精 (WF)参照文献[8]的方法，用0．1％透明质 牛、羊卵母细胞冷冻保存研究表明，不同发育阶段的卵母 酸酶于38．5℃处理卵母细胞3—5rain，吹打去除卵丘细胞 ， 细胞抵抗冷冻损伤的能力存在差异 。迄今为止，冷冻保存 再用TCM199和mTBM液各洗2次，移人mTBM微滴 (50 1) 卵母细胞的研究主要集中于成熟期卵母细胞 。与成熟期 中等待受精(15～20枚／滴)，新鲜猪精液经离心清洗后用添 卵母细胞相比，未成熟卵母细胞对冷冻更为敏感，其原因仍不 加 100 Illl肝素的mTBM调节精子密度至 1．0×10。／ml备 清楚。本试验旨在探索脂质对猪未成熟卵母细胞超低温冷冻 用。取50 l精子加入卵母细胞微滴中共同孵育6～8h，最 保存的影响，以期为进一步研究和建立有效的猪卵母细胞冷 后转入经预平衡的NCSU一23培养液中，在 38．5℃、5％CO， 冻保存方法奠定基础。 气相及饱和湿度条件下培养。 1 材料与方法 1．4 电镜样本制作