1个重型遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系分子遗传分析.pdfVIP

230 JInternMedConceptsPract2011，Vo1．6，No．3 ． 研 究 报 道 ． 1个重型遗传性凝血因子V0缺陷症家系分子遗传分析 高 晶 ， 丁秋兰 ， 王学锋 ， 刘晓艳 (1．复旦大学附属妇产科医院检验科 ，上海 200011； 2．上海交通大学医学院附属瑞金医院临床输血科 ，上海 200025) 关键词 ：遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症 ； 基因突变 ； 移码突变 中图分类号 ：R554．2 文献识别码 ：B 文章编号 ：1673—6087(2011)03—0230—03 凝血因子VII(FVII)在肝脏中合成并以单链酶原的形式 分为 2个 区域分别设计 了2对引物 ：其他外显子及启动子 分泌到血浆中，活化的FX(FXa)、FIXa及 FVlIa(自身)可将 分别设计 1对引物 (见表 1)，用 Primer5软件设 计引物 ．在 FVlI在 Arg152一Ile153肽键处裂解成轻链 (152AA1和重链 391DNA合成仪 (AppliedBiosystems，美国)上进行合成。 (254AA)．使其变成 FVIIa。在血管损伤后 。FVIIa与组织因子 五 、PCR扩增 (TF)结合形成复合物 (FⅦa／TF)．激活 FX、FIX等，在 内源及 100 L的 PCR反 应体系包 括 ：1倍 PCR缓 冲液 ． 外源凝血途径的激活过程中均发挥重要作用 遗传性FVII缺 1．5mmol／LMgC12．0．25mmol／L脱氧核糖核苷酸 (dNTPs)． 陷症是 由FⅧ 基 因突变所致的 1种少见的常染色体隐性遗 O．5Ixmol／L5’端和 3’端 PCR引物 ．500ngDNA模板 ．2．5U 传出血病．男女均可罹患。发病率约 1／5O0000 最新的F TaqDNA聚合酶 (PCR反应试剂均为 Takara公司产 品) 突变数据库显示 ．目前发现的F 基因突变有 130多种 ．包 PCR反应在 PTC一200型 PCR仪 (美国MJResearch公司1上 括错义、无义、剪切位点、启动子、小的插入或缺失等 6种突 进行 ，反应条件 ：95℃变性 30S：根据引物的不 同分圳任 变 ．其 中错义突变最多．约占70％．最少见的突变是小的插入 58qC～62℃退火 30S；72oC延伸 30S，30个循环(见表 1)。其 或缺失l】l本研究对 1例遗传性 FⅦ缺陷症患者及其家系成员 中3、4号引物所扩增序列 内部存在二级结构 ．采用降落 FⅢ基 因进行检测 ．观察基因突变与临床出血的关系 ．探讨其 PCR法扩增 ，反应条件为 ：97~C变性 20s：62~C退火 45s：72℃ FVlI功能异常的分子机制 延伸 90S，5个循环 ；95℃变性 20S：60℃退火 45S：72℃延伸 90s．25个循环 5uIPCR产物在 1．0％琼脂糖凝胶上 电泳 材 料和方法 鉴定 ．用 DL2000标记鉴定 ．． 六、PCR产物的纯化和测序分析 一 、 家系情况 PCR产物直接用 3S柱离心式 PCR产物小量快速抽提 先证者 ，女，18岁，自幼有 自发出血史，轻微外伤后 出血 试剂盒进行纯化 (上海 申能博彩生物科技有 限公司)．以制 难止 ．反复关节腔及肌 肉内出血 ，月经量多，有 2次输血史， 备测序模板 ．采用双脱氧链终止法在 ABI377测序仪上进行 每