柱状黄杆菌乙酰辅酶A合成酶基因及其上游调控序列分析.pdfVIP

中国水产科学 2011年9月，18(5)：l100-1107 JournalofFisherySciencesofChina 研 究论 文 D0I：l0．3724／SP．J．1118．2011．01100 柱状黄杆菌乙酰辅酶A合成酶基因及其上游调控序列分析 张金，邹红，姚卫建，聂品 中国科学院 水生生物研究所 淡水生态与生物技术国家重点实验室，湖北 武汉 430072 摘要：柱状黄杆菌(Flavobacteriumcolumnare)是世界范围内危害淡水鱼类的柱形病的病原。目前对该病原菌遗传操 作系统的研究进展较慢，而寻找高效稳定的启动子来调控外源基因在细菌体内的表达，有可能促进该细菌遗传操 作系统的构建。本研究获得了柱状黄杆菌乙酰辅酶A合成酶基因(acety1．coenzymeAsynthetasegene，acs)的编码序 列及其上游调控序列，该基因全长2323bp，编码635个氨基酸。通过序列分析，发现在该基因起始密码子ATG的 上游存在核糖体结合位点(ribosomebidingsite，RBS)序列TAAAA，和启动子一7和一33的保守基序 TATTTTCG和 TTG。将 acs的上游调控序列(promotersequence，Pacs)置于氯霉素抗性基因(chloramphenicolacetyltransferase，cat) 的上游并导入柱状黄杆菌G4株后，cat基因得以表达，并使宿主细胞产生稳定的氯霉素抗性。通过5RACE技术，确 定了外源的cat基因和内源的aCS基因的转录起始位点都是位于起始密码子上游 46bp处的T。通过删减分析调控 序列 Pacs，发现起始密码子上游 164bp的序列是保持启动子活性所必需的。通过分析和比对 32个基因的核糖体 结合位点区域，在起始密码子上游 l0bp处发现了RBS保守基序TAAAA。 关键词：柱状黄杆菌；乙酰辅酶A合成酶基因；启动子；核糖体结合位点 中图分类号：$941 文献标志码：A 文章编号：1005-8737一(2011)05—1100-08 柱状黄杆菌(Fiavobacterium columnare)隶属 有利于实现外源基因在柱状黄杆菌细胞内的表达。 于拟杆菌门、黄杆菌纲、黄杆菌 目、黄杆菌科，是 乙酰辅酶 A是生物体 内重要的化学物质，它 淡水鱼类的重要致病菌，它引起的柱形病在世界 是丙酮酸氧化脱羧和脂肪酸 ．氧化的产物，也是 范围内都有报道 1【】。患柱形病的鱼往往出现烂鳃、 脂肪酸合成、胆固醇合成和酮体生成的碳来源。 体表溃疡、鳍条腐烂等症状，且有很高的死亡率， 蛋白质、糖、脂肪这三大类营养物质最终都会被 给养殖生产带来巨大的经济损失[2J。柱状黄杆菌 彻底氧化成乙酰辅酶 A进入三羧酸循环，为生物 是噬纤维菌属(Cytophaga)、黄杆菌属(Flavobac— 体提供能量，或者通过乙醛酸旁路产生生物合成 terium)和拟杆菌属(Bacteroides)家族(CFB)的一个 所需的物质 l【训。乙酰辅酶A有以下2种合成途径： 成员。到 目前为止，对这些细菌遗传操作系统的 乙酸在乙酸激酶和磷酸转乙酰酶的作用下转化成 构建进展缓慢，尽管已有关于柱状黄杆菌遗传操 乙酰辅酶 A；通过乙酰辅酶 A 合成酶(acety1． 作系统的报道 4【]。在变形菌中经常使用的质粒、 coenzymeAsynthetase，Acs)一步将乙酸转化成乙 筛选标记和启动子等都不能在这类细菌中有效地 酰辅酶A[nl。由于 ACS参与乙酰辅酶A的合成， 发挥作用[5-7]，因为这些广泛应用的遗传元件的启 与生物体的新陈代谢相关，因此推测柱状黄杆菌 动子在 CFB家族细菌中基本都不能正常表达[8-9]。 的乙酰辅酶A合成酶基因(acs)的调控序列很可能 因此，从柱状黄杆菌中分离高效稳定的启动子可能 含有比较强的能够持续驱动基因表达的启动子。 收稿 日期 ：201l-04-0l；修订 日期：2011-06—05． 基金项目：国家重点基础研究发展计划项 目(2009CB118703)． 作者简介：~ (z981一)，博士研究生，主要从事水产病原微生物研究．E-mail：z