亨德拉检疫技术规范.docVIP

前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准参考了国际动物卫生组织《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2013版）第2.9.6章中亨德拉和尼帕病毒诊断中的相关技术。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国烟台出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：尹伟力、孙涛、梁成珠、粟智平、王群、刘宁。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 亨德拉检疫技术规范 范围 本标准规定了亨德拉病的临床诊断、病毒微量中和滴定实验、实时荧光聚合酶链式反应（Real-time PCR）、免疫组织化学染色技术、酶联免疫吸附实验(ELISA)操作的技术要求。 本标准适用于进出口马属动物（如马、驴、骡等）亨德拉病毒的检疫、亨德拉病原的实验室诊断和血清学调查；也适用于兽医相关部门对亨德拉疾病的流行病学调查以及对亨尼帕病毒的分类学研究。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 OIE《Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals》第6版（2013），第2.9.6 “亨德拉和尼帕病”部分。 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程。 GB 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 GB 19489 实验室生物安全通用要求。 生物安全措施 为了防止疫病传播，同时保护实验人员的安全，试验必须由具有一定资格的专业技术人员操作，所有经前处理的检测病料及样品、培养物及废弃物等须经高压灭菌处理。试验环境和防护要求严格遵守GB 19489。 现场检疫 对进出境或养殖场的马进行现场检疫。 4.1查询疫病(情)背景 向畜主和相关兽医人员了解该群马的发病情况并检查疫病记录；核查被检群体是否有亨德拉疫情的发病史，是否出现过亨德拉病临床诊断病例，是否有与感染亨德拉病例的接触史；详细了解该饲养场及地区和周边地区是否有果蝠等中间宿主的存在；对入境动物，须核查是否来自疫区，充分调查和了解所在国家及地区亨德拉流行病史；查询运行日志，了解运输工具的运载状况及消毒情况；了解运输路线、途经国家或地区是否为亨德拉病疫区，并查询运输过程中是否有停靠疫区的记录；查验相关产地检疫证书或相关的正规疫病检测报告。 4.2临床诊断 在马匹上由亨德拉病毒引起呼吸道疾病通常是致命性的但是以低传播性为特征。因此临床诊断的意义仅具有辅助性。通常亨德拉病毒感染马匹后，会出现以渐进性高热，面部肿大，严重呼吸困难，末期，多泡沫性流涕的典型症状。许多马还会表现神经症状。尸检发现，共同症状为肺部淋巴结肿大，严重者肺部水肿、充血。 样品的抽样和传递 5.1 病料的采集 因为该病毒感染后具备高死亡率且没有疫苗或有效的抗病毒手段，该病原体对人极具危险，因此亨德拉病毒或者尼帕病毒归生物安全四级实验室处理。生物安全四级机构需与世界动物卫生组织(OIE)生物安全守则1.1.2章节阐述的相同，其兽医微生物实验室的生物安全性和动物设备还需提供附加说明。样品组织的采集范围主要包括脑、肺、肾脏、脾脏和血清。 病料样品的保存与传递 样品的运输如在48小时内能到达实验室则只需保存在4℃环境下；若运输时间超过48小时，则样品需在干冰或液氮状态下冰冻运输，样品不应长时间保持在-20℃。用于诊断的样品需经特殊材质的容器传递到指定实验室。国际航空运输协会（IATA），危险品运输条例（DGR）对运输可疑动物传染病样品的需遵守此条例 病料样品前处理 全血样品的处理：取抗凝血加入2-3倍体积红细胞裂解液，混匀静止4min-5min，待红细胞完全破碎，1500r/min离心5min，弃上清除去破碎的红细胞，得到白细胞沉淀（若仍有红细胞，则重复上述步骤，直到红细胞除尽）。加入PBS缓冲液，制成白细胞悬液，反复冻融两次，低温（-20℃）保存备用。 5.3.2 动物组织样品的处理：所有实验室接收的组织样品均需在无菌条件下进行处理。在生物安全柜中处理或者离心等均会产生气溶胶覆盖，因此可在封闭的均浆机中加10%的混悬液进行研磨，或者用能经受住压热器作用的钢珠在封闭气缸中进行磨碎。制备成组织悬液。再加培养液，制成终浓度为10%的组织悬液。以2000r/min离心10min，收取上清液低温（-20℃）保存备用。所有这些过程均需要在三级生物安全柜或者配以个人防护措施的二级生物安全柜中进行。 病原分离鉴定 仪器设备 生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮贮存罐、高压灭菌锅、微量细胞培养板、微型振荡器、吸管（1mL、2