青枯雷尔氏菌绿色荧光蛋白基因转化及其微生物学异质性研究（.docVIP

青枯雷尔氏菌绿色荧光蛋白基因转化及其性( 摘要：采用电击方法对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）进行gfp/luxAB基因的双标记，试验结果表明，成功的采用gfp/luxAB标记了青枯雷尔氏菌。标记后的菌体细胞形状与亲本菌株形状相同，均为长椭圆形，近杆状，整个细胞呈现绿色荧光，PCR结果表明，从标记菌株的基因组DNA中扩增出约3.0 Kb的gfp基因片段。标记菌在0.1×TSB培养过程中荧光素酶活性监测发现，在标记菌的对数生长期，荧光素酶活性快速增加，到了稳定期，由于细胞代谢活性下降导致荧光素酶活性降低，而对照的出发菌株整个生长过程均检测不到荧光素酶活性。对标记前后的生长曲线的比较说明标记菌株的代时延长了24%。在无选择压力条件下连续继代20次，所有菌落都仍然保持均匀而且强烈的绿色荧光，说明标记基因在标记菌中的稳定性很高，转接至第20代荧光稳定性还保持在100%。以上结果表明，gfp和luxAB融合基因成功地转化青枯雷尔氏菌并在标记菌株中得到高效稳定的表达。 关键词：青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）；电转化；gfp/luxAB基因 GFP tagging Ralstonia solanacearum with gfp/luxAB mini-Tn5 Abstract: The Ralstonia solanacearum strain was chromosomally tagged with the marker genes gfp andluxAB by electroporation with a pUTmini-Tn5 transposon vector. Transformants were screened for the green fluorescence phenotype of the gfp marker by fluorescence stereomicroscopy. A 3.0 Kb fragment of the gfp gene and luxAB gene was amplified from the genome DNA of the GFP-tagged strains. Morphologically the cells of the engineered strain were similar to the original strain as determined by laser scanning confocal microscopy. Luciferase activity of the GFP-tagged strain increased rapidly during log phase growth in 0.1×TSB medium, but decreased in stationary phase. The standard growth curve of the strain the GFP-tagged strain was delayed by 24% than the wild type one. And the green fluorescence could be kept until 20 times of subcultures. These results confirmed that the dual marker was inserted successfully into the Ralstonia solanacearum strain. Key words: ralstonia solanacearum，electrotransformation，gfp/luxAB gene 绿色荧光蛋白（GFP）最早是从水母中分离出来的，是一种非酶性报告因子，该蛋白能够自身催化形成发色结构并在紫外或蓝光激发下发出绿色荧光，作为报告基因，GFP是目前能在活细胞中表达的发光蛋白之一，作为荧光标记分子，GFP既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害[1]。GFP检测方便，荧光稳定，易于构建载体且对活细胞无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞可以继续传代[1]。利用GFP标记进行病原菌侵入活体细胞过程的跟踪观察更开创了病理学研究的新时代。Casey等[2]的研究证明了荧光与菌体细胞数量呈线性关系，也为通过荧光直接对细菌记数提供了一个方便快捷的方法。 植物细菌性青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum），，44个科数百种植物[3]。植物青枯细菌致病分子机制的研究是国际上植物与微生物相互作用机制研究的重要领域之一。在植物根际土壤中和植株体内存在着大量的，这给研究。从而为更