恶性疟原虫现场样品HRP-Ⅱ基因部分序列分析.pdfVIP

维普资讯 中国寄生虫病防治杂志 2004年 1O月 第 17卷第 5期 ChinJ ParasitDisCon October2004， Vo1．17，No．5 · 论著 · 恶性疟原虫现场样品HRP一Ⅱ基因部分序列分析* 汪俊云，洪远 东，杨明涛，包意芳 (中国疾病预防控制 中心寄生虫病预防控制所 ，上海 200025) 【摘要】 目的 分析和 比较不 同地理株恶性疟原虫现场样品及我国恶性疟原虫现场样品与实验室培养虫株在 HRP一Ⅱ 基 因上 的多态性 。 方法 分别 以在 中国感染 的恶性疟病人和在非洲感染 的恶性疟病人全血为材料 ，PCR扩增 HRP一 Ⅱ基因片段 ，扩增的产物分别克隆于pUCm—T载体并进行测序，用 GENEDOC软件 比较分析核苷酸序列及其推导的氨 基酸序列的同源性。 结果 从 中国海南省和云南省恶性疟病人血样 中扩增出序列和长度完全相 同的片段，大小为 447bp；从在非洲感染的恶性疟病人血样中扩增出813bp的片段；中国恶性疟原虫实验室培养株相应核苷酸序列长度为 870bp。从中国恶性疟病人血样扩增出的HRP—II基因片段序列与从非洲恶性疟病人血样扩增出的 HRP—II基因片段 序列及我国恶性疟原虫培养株相应的核苷酸序列相 比，不但有多个长短不等序列的缺失和插入，还有多个碱基发生了 突变；比较推导的氨基酸序列，除了有多个长短不等氨基酸序列的缺失和插入外 ，其他氨基酸残基没有发生改变。 结 论 恶性疟原虫HRP—II基因在不同地理株 问存在差异，在 同一地理株的实验室培养株与现场样品问也存在差异，这些 差异主要表现为长度差异和少量碱基变异 。 【关键词】 疟原虫，恶性 ；HRP一基 因；多态性 【中图分类号】 R382．31 【文献标识码】 A 【文章编号】 1001—6627(2004)05—0257—04 富组蛋 白lI(Histidine-richprotein一Ⅱ，HRP-Ⅱ) 3．1．1 引物 根据 已发表 的恶性疟原虫 HRP—lI基 为红内期恶性疟原虫合成的一种水溶性糖蛋 白，由于 因保守序列和引物设计原则设计 1对引物，P1：5r_ 其含有大片段连续 串联排列的氨基酸重复序列 ，因而 ACTCAAGCACATGTAGATGATG一3 ； P2： 5一 是理想的诊断靶分子。迄今，已有多个基于此蛋白开 TCAATGGCGTAGGCAATGTGTG一3。引 物 由上 发的诊断产品问世 ]，另外 ，此蛋 白还作为保护性疫苗 海 申能博彩生物技术有限公司合成。 候选抗原而加以研究 ¨2]。对编码此蛋 白基因的分析大 3．1．2 模板处理 现场恶性疟病人抗凝全血按文献 都以实验室培养 的虫株为材料 (实验室培养株)进行 ， [3]方法处理直接作为PCR扩增模板 。 因此有必要 以现场采集的样品为材料对 HRP—lI基因 3．1．3 PCR扩增 按 50 1反应体积在上述沉淀物 进行深入分析研究，这不但能考察该基因是否稳定，也 中加 49．5tAPCR反应液 (含 200tlmol／IdATP／dT— 可判断基于此蛋白开发的疫苗和诊断产品现场的适用 TP／dGTP／dCTP，200pmol／I 引 物，1．5mmol／I 性。为此本研究分别 以在 中国感染 的恶性疟病人和在 Mg。。)，加封石蜡油 50 1后置沸水煮沸 10min，置已 非洲感染的恶性疟病人全血为材料扩增 了HRP—lI基 热启动 的PCR仪 ，按下述条件进行扩增反应 ：94C变 因片段 ，并比较分析了它们间的同源性 ；同时也对中国 性 3min，加 0．5tzlTaq聚合酶 (5U／tz1)。再按 94C 恶性疟原虫现场样品扩增的HRP—lI基因部分序列与 3oS，56℃ 45S，72℃ lmin循环 35次，