柔嫩艾美耳球虫A08基因的阶段表达分析与毕赤酵母表达系统构建.pdfVIP

第 33卷第6期 西 南 大 学 学 报 (自然科学版) 2011年 6月 Vo1．33 No．6 JournalofSouthwestUniversity(NaturalScienceEdition) Jun． 2011 文章编号 ：1673—9868(2011)06—0019—06 柔嫩艾美耳球虫A08基因的阶段表达分析 与毕赤酵母表达系统构建 平宪卿， 韩红玉， 黄 兵， 姜连连， 董 辉 ， 赵其平， 李 洋， 郭 涛， 朱顺海 中国农业科学院 上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室 ，上海 200241 摘要 ：对 A08蛋 白基 因在柔嫩艾美耳球虫不 同发育阶段 (未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)的转录情 况进 行分析 ，同时以AO8蛋 白cDNA为模板扩增 出1083bp的 目的基 因片段 ，将该基 因连接到 pGEM—T—easy载体 上 ，经序列测定和双酶切鉴定表 明为 AO8基 因．用 EcoRI和 NotI酶切 回收 目的片段连接至用 同样酶切的真核表 达载体 pPIC9k上 ，构建 了重组质粒 pPICgk—A08，转化大肠杆菌 TOP10后 ，提取质粒 ，经酶切鉴定正确后用 SacI 将重组质粒线性化 ，再 电转入毕赤酵母 GS115菌株 ，G418筛选抗性重组子，经PCR鉴定正确重组子后做 甲醇诱导 表达．R，r_PCR结果显示该基 因在子孢子阶段 的转录拷 贝数显著高于其他发育阶段 ，是一个子孢子高表达基 因．重 组酵母诱导表达产物经SDS检测证实，柔嫩艾美耳球 虫A08基 因在毕赤酵母 中获得表达．Western-blot初 步分析表 明，表达产物具有免疫学反应活性． 关 键 词 ：A08基 因；柔嫩艾美耳球虫；荧光实时定量 PCR；毕赤酵母 ；表达 中图分类号 ：$852．72 3 文献标志码 ：A 鸡球虫是对鸡危害最严重的寄生虫之一 ，寄生于鸡的肠道 ，可引起鸡只大批死亡，严重威胁养鸡业 的 发展．而柔嫩艾美耳球虫 (Eimeriatenella)又是鸡球虫中致病性最强 的一种 ，目前对于鸡球虫病的控制 ， 仍以药物预防为主．近年来 ，亚单位疫苗和基因工程疫苗等新型疫苗的研制又成为控制鸡球虫病 的新发展 方向，而获得高保护力的靶标抗原正是开发新型疫苗的前提．球虫生活史复杂 ，既包括细胞外 的入侵阶段 ， 也包括细胞内的繁殖阶段．球虫能在鸡肠道 内生存和繁殖 ，需要子孢子或裂殖子 (入侵阶段虫体)去识别、 结合和入侵肠道上皮细胞．在整个入侵过程中，虫体将分泌多种与入侵相关的因子发挥作用 ，这些入侵相 关因子主要包括微线蛋 白、棒状体蛋白及多种蛋白激酶 J．抑制这些因子的功能将有效地降低虫体对宿 主细胞的入侵 ，减弱虫体的致病力 -4． 为了大规模筛选子孢子差异表达基 因，韩红玉等 应用抑制性消减杂交技术和 cDNA微阵列技术 ，获 得 了大量柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊和子孢子差异表达基 因的表达序列标签 (EsTs)，其 中一个 EST基因 在子孢子阶段高表达 (克隆号：ZBI—A08)，用RACE技术扩增得到该子孢子高表达基因的全长cDNA，含 1 个 1083bp的ORF，编码为 360个氨基酸 ，理论分子量为 3．86×10；序列比对发现，该基因的编码产物 与原生动物界任何 已知 的蛋 白分子没有 明显 的同源性，视为新基 因，标记为 A08(Genbank登录号 ： 收稿 日期 ：2O10—04—09 基金项 目：国家高新技术研究发展计划 资助项 目(2006AA10A207—1)． 作者简介 ：平宪卿(1983一)，男 ，河南新郑人 ，硕士研究生 ，主要从事球虫生物学研究 通信作者 ：黄 兵，研究员． 2O 西南大学学报 (自然科 学版) 第 33卷 EF552217)．为了观测该基因在球虫发育相关阶段的表达情况 ，并构建真核表达系统 ，为深入研究 A08基 因的生物学功能奠定基础 ，进行了本项研究． 1 材料与方法 1．1 实验动物 AA雏鸡购 自上海市浦东新 旗杆种禽场 ． 1．2 虫种 、质