N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆、表达及产物纯化.pdfVIP

第40卷第 6期 温 州 医 学 院 学 报 Vo1．40No．6 2010鸳 11 JournalofWenzhouMedicalCollege Nov2Ol0 隧 l N一乙酰一D一葡萄糖胺一2一差向异构酶基因的 克隆、表达及产物纯化 余云彦，张卫星 ，闫欣欣，唐琴琴，刘乃华，晏永波，李校墅，林绍强 (温州医学院 药学院，浙江 温州 325035) [摘 要]目的：从猪g-中提取RNA，从中克隆出N一乙酰一D一葡萄糖胺一2差向异构酶(GNE)基因，并在大肠 杆菌E．coliBL21(DE3)中表达。方法：从猪肾中提取总RNA，通过RT—PCR克隆出GNE基因，经测序，感受 态大肠杆菌E．coliDHSa转化，质柱抽提，鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3)转化表达，通过His—tag亲和 纯化 (NiSepharose6FastFlow)，G一25柱脱盐，SDS—PAGE电泳检测。结果：RNA提取物经紫外分光光 度计检测OD26O／OD28O=1．77，说明无明显的蛋 白质和酚污染。RT—PCR扩增 目的片段 ，测序证 明该基因的 0RF为1206bp，编码402个氨基酸组成的酶蛋 白 (GNE)。SDS—PAGE显示 ，纯化蛋 白为45kD的单一条带， 与基因序列推测值一致。结论：GNE基因已被成功地克隆和表达。 [关键词] N一乙酰一D一萄糖胺一2一差向异构酶；基因；克隆；纯化；猪 [中图分类号] R9 [文献标识码] A [文章编号] 1000—2138(2010)06—0531—05 Cloning，expression and purification of N~cetyl—D-glucosamine-2Hpimerase YU Yunyan，ZHANG #~ixing．YAN Xinxin，TANG Qfnqfn．LIU Naihua YAN Yongbo LIXiaokun LIN Shaoqiang． Yhe Pharmacy School of #~nzhou Medical College #~nzhou 325035 Objective：Toclone thegeneofN—acetyl—D—glucosamine一2一epimeraseaccording toRNA extractedfrompigkidneyandexpressitin E．coliBL21(DE3)and thenpurifytheproduct．Methods： RNA was extracted from porcine kidney to clone the gene of N．．acetyl-．D-glucosamine．．2．．epimerasewith RT—PCR followed by sequencing．Recombinant plasmid was converted into E．coliDH5a and to identify itfollowedbytheconxersionoftherecombinantplasmidinE．coliBL21(DE3)andexpression．The proteinwaspurifiedbyHis-tag(NiSepharose6FastFlow)，desaltedbyG-25columnandidentified by SDS—PAGE．Result：RNA was extracted from porcinekidney and identified with u1traviolet spectr0photometer：0D260=0．03,t6，0D280=0．0I95，OD26O／OD28O=1．77(between1．7and2．2)，itshowed that therewas no protein and phenol contamination．Amplification of GNE with RT-PCR the sequence