NY_T 1963—2010 马铃薯品种鉴定.docVIP

中华人民共和国农业行业标准 NY/T 1963—2010 马铃薯品种鉴定 Cultivar identification of potato 2010-12-23 发布 2011-02-01实施前 言 本标准遵照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心（哈尔滨）。 本标准主要起草人：吕典秋、王绍鹏、刘尚武、邱彩玲、宿飞飞、李勇、高云飞、王文重、张抒、王亚洲、马铃薯品种鉴定 1 范围 本标准规定了马铃薯品种鉴定SSR分子标记方法。 本标准适用于马铃薯品种及种质资源鉴定。 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 GB 7331 马铃薯种薯产地检疫规程 GB 18133 马铃薯脱毒种薯 DNA的提取及PCR扩增所使用的实验室独立，微量移液器为分子检测专用。试验中，溴化乙锭染 色剂可诱发基因突变，丙烯酰胺水溶液具有神经毒性，操作人员在操作过程中需佩戴手套和口罩。电泳 后的凝胶以及被溴化乙锭污染的物品要有专用收集处，集中进行无害化处理。 以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GB/T 6682中规定的一级水。 1 mol/L三羟基甲基氨基甲烷—盐酸 (Tris-HCl )溶液(pH 8.0) 称取Tris碱121.1 g，溶解于800 mL水中，用浓盐酸调pH至8.0，加水定容至1000 mL，121℃高 压灭菌20 min。 0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH 8.0) 称取乙二铵四乙酸二钠186.1 g，溶于700 m水中，用氢氧化钠调pH至8.0，加水定容至1 000 mL。 TE缓冲液(pH 8.0) 量取1 mol/ L三羟基甲基氨基甲烷盐酸(TrisHCl)溶液(3. 1) 2 mL、0.5 mol/L乙二铵四乙酸二 钠溶液(3.2) 0.4 m L，加水溶解，定容至200 mL，121℃高压灭菌20 min后，室温保存。 5×Tris-硼酸(TBE)电泳缓冲液 称取Tris碱27 g、硼酸1375 g，量取0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液 (3. 2) 10 mL，加灭菌双蒸 水400 mL溶解，定容至500 mL。 1×Tris-硼酸(TBE)电泳缓冲液 量取5×Tris硼酸(TBE)电泳缓冲液(3. 4) 200 mL，加水定容至1000 mL。 称取氯化钠15.2 g、十二烷基磺酸钠(SDS) 0.4 g、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP) 2 g、二硫苏糖醇(DTT) 0309 g，溶于100 mL双蒸水中，再加入0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液 (3.2) 20 mL、1 mol/L三羟 基甲基氨基甲烷盐酸 (TrisHCl)溶液(3.1) 20 mL、Tritron X00 1 mL、β巯基乙醇0.8 mL，混合均 匀，加水定容至200 m，4℃贮存待用。 Tris饱和酚十三氯甲烷十异戊醇混合液（现用现配） 量取Tris饱和酚25 mL、三氯甲烷24 mL、异戊醇1 mL，混合均匀待用。 3.8 30%丙烯酰胺溶液 称取丙烯酰胺29 g、N，N亚甲基双丙烯酰胺l g，加水溶解，定容至100 mL，过滤，4℃储存。 3.910%过硫酸铵溶液（现用现配） 称取0.1 g过硫酸铵，加水溶解，定容至1 mL。 3.10 12%聚丙烯酰胺凝胶（双板） 量取30%丙烯酰胺溶液(3. 8)20 mL、5×Tris硼酸(TBE)电泳缓冲液(3. 5)10 mL、灭菌双蒸水25 mL、四甲基乙二胺(TEMED) 50 μL，混匀，制板前加过硫酸铵溶液(3. 9) 500 μL，混匀，灌胶。 3.11 溴化乙锭贮液( 10 mg/mL) 称取溴化乙锭200 mg，加水溶解，定容至20 mL。 3.12溴化乙锭染色液(0.5 μg/mL) 量取溴化乙锭贮液(3. 11) 10 μL，加水定容至200 m L。 3.13 3 mo/L乙酸钠溶液( pH 5.2) 称取乙酸钠3H2O 24.6 g，加水80 mL溶解，用冰乙酸调pH至5.2，定容至100 mL。 100 bp DNA分子量标准物 3.1