参附注射液、高乌甲素注射液诱导白血病细胞株HL-60分化、凋亡的研究.docVIP

参附注射液、高乌甲素注射液诱导白血病细胞株HL-60分化、凋亡的研究 作者：伍耀衡, 宁异真, 许建邦, 谭宇蕙, 吴映雅, 严定安, 吕国全 【摘要】 【目的】观察参附注射液及高乌甲素注射液诱导白血病细胞株HL-60分化、凋亡的作用，初步验证温阳法治疗肿瘤的理论。【方法】采用人类急性白血病细胞株HL-60为模型，设参附注射液组（终浓度分别为12.5、25、50、100μL/mL）,高乌甲素组（终浓度分别为25、50、100μL/mL），亚砷酸钠对照组（终浓度分别为0.25、2、15μmol/L）及阴性对照组；检测细胞增殖、细胞形态、硝基四氮唑蓝（NBT）还原能力、细胞周期分布、凋亡率等指标。【结果】参附注射液作用后HL-60细胞增殖受抑制，高乌甲素注射液对HL-60的生长无抑制作用；经药物处理60h后HL-60细胞均出现程度不同以凋亡为主的形态改变；低浓度参附注射液（12.5μL/mL）、高乌甲素注射液（50μL/mL）作用60h后HL-60细胞NBT还原能力增强，而其他浓度组 NBT还原能力反未增强；药物处理60h后，100μL/mL高乌甲素液及25.50μL/mL参附液流式细胞仪检测直方图上呈现亚二倍体凋亡峰，凋亡率呈不同程度增高。【结论】参附注射液、高乌甲素注射液对人类急性白血病细胞株HL-60具有不同程度的诱导分化和凋亡的双重作用，为温阳法治疗肿瘤提供了一定的理论依据。 【关键词】 参附注射液／药理学； 高乌甲素注射液／药理学； 白血病／中药疗法； 肿瘤细胞／病理学； 细胞凋亡；细胞培养 　　近年来中医药抗肿瘤研究领域根据《内经》“积之始生，得寒乃生，厥乃成积”、“阳化气，阴成形”的理论，逐步重视温阳法的研究［1-5］。乌头碱、人参皂苷类物质抗肿瘤的研究也逐渐开展，在常用的中药中，温阳作用效强力专者首推附子类药物，其中所含乌头碱类物质是其主要效应成分。结合我们临床应用温肾法为主治疗肿瘤经验，本文从诱导分化、凋亡角度，观察临床常用的温阳法代表针剂——参附注射液及乌头碱类药物高乌甲素（拉巴乌头碱、刺乌头碱）注射液对人类急性白血病细胞株HL-60的作用，现报道如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要药物 参附注射液每毫升相当于生药红参0.1g,附片0.2g，由雅安三九药业有限公司生产（批号；氢溴酸高乌甲素注射液（2mg/mL，由广州天心药业股份有限公司生产 ，批号：040501）；亚砷酸氯化钠注射液由哈尔滨伊达药业有限公司生产（批号。以上药物均购自广东省中医院药房，临用时以磷酸盐缓冲溶液（PBS）稀释。 　　1.2 主要试剂 二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）均由Sigma公司生产；Wright-Giemsa混合染液由广州人仁公司提供；佛波酯（TPA）由Clbiochem公司生产；硝基四氮唑蓝（NBT）由Mbchem公司生产；碘化丙啶（PI）染色液由Becton Dickinson公司生产。 　　1.3 主要仪器 Bio-Rad-450型全自动酶标仪为美国Bio-Rad公司产品；150-400型细胞培养箱为英国Biotech公司产品；3169型倒置显微镜为日本Nikon公司产品；SW-CJ-IF型超净工作台为苏州净化设备厂产品；TGL-16型高速冷冻离心机为德国Sigma公司产品；NexPower1000型纯水器为韩国Human Corp产品； FACSCalibur型流式细胞仪为Becton Dickinson公司产品；普利生MIAS 2000型智能骨髓图像分析系统为北京—深圳普利生公司产品；Nikon E200型普通光学显微镜为日本Nikon公司产品。 　　1.4 细胞模型 HL-60细胞株购自中山大学动物中心细胞库，在广州中医药大学基础医学院生化教研室实验室传代培养。实验时取对数生长期细胞， 2g/L台盼蓝拒染实验证实活细胞数大于95%，并调整实验时所需密度。 　　1.5 实验方法和检测指标［6－9］ 　　1.5.1 分组 设参附注射液、氢溴酸高乌甲素注射液实验组（简称参附液组、高乌甲素组），在实验的不同阶段，参附液组终浓度分别为12.5、25、50、100μL/mL，高乌甲素组终浓度分别为25、50、100μL/mL，亚砷酸钠对照组则取0.25、2、15μmol/L 3个浓度。并设空白（本底）对照组、阴性对照组。 　　1.5.2 细胞加药培养 在实验的不同阶段，按相应的设计要求接种制备好的细胞悬液到12或96孔培养板中（每孔细胞量见具体项目），分别加培养基及药物。96孔培养板中每孔加含体积分数为15%小牛血清的RPMI-1640培养基180μL，然后按