光谱法研究金属离子与肿瘤抑制蛋白p53的DNA结合结构域的相互作用.docVIP

光谱法研究金属离子与肿瘤抑制蛋白p53的DNA结合结构域的相互作用 【摘要】 利用荧光滴定法研究了9种金属离子与序列特异性的DNA结合结构域(p53DBD)的结合反应，其结合能力依次为Fe3+gt;Zn2+gt;Cu2+gt;Ca2+gt;Mg2+gt;Ba2+gt;Mn2+gt;Ni2+gt;Co2+。圆二色谱研究结果表明，Ba2+, Ca2+, Co2+, Mn2+及Ni2+并未引起蛋白二级结构变化;　Zn2+, Mg2+及Fe3+诱导蛋白结构细微调整;而Cu2+结合导致蛋白螺旋结构大量丢失。ANS结合研究结果表明, Mg2+与Zn2+相似，诱导p53DBD蛋白表面疏水性增强，而Fe3+引起p53DBD蛋白表面疏水性降低。因此，Mg2+和Fe3+可能是影响或调节p53活性的潜在因子之一。 【关键词】 金属离子, 蛋白结构, 亲和性, 疏水性, 荧光光谱 　　1 引 言 　　自然界中大约1/4的蛋白需要金属离子的协助才能发挥正常功能[1,2]。肿瘤抑制蛋白p53是Zn2+结合蛋白，它调控很多重要的生物学过程[3]。p53响应于多种DNA损伤事件，被激活后作为一个转录因子进一步激活下游基因，从而可以导致细胞周期停留在G1/S期修复或者诱导凋亡[4]。所有这些已知的生物学功能都依赖于其DNA结合特性[5]。野生型p53通过一个序列特异性的DNA结合结构域(p53DBD)来结合DNA[6]。p53基因在50%肿瘤中发生突变[7]，而这些突变主要发生在p53DBD，突变的p53不能激活下游基因转录[8]。因此，p53DBD结合和转录激活活性是p53最关键的生物学功能。晶体结构研究结果表明，p53核心结构域结构为β三明治结构形成脚手架，支撑2个大环和1个环片层螺旋模序。2个大环形成空腔结合Zn2+，而环片层螺旋模序形成p53DNA结合表面。p53DBD上的3个半胱氨酸(Cys176, Cys238和Cys242)和1个组氨酸(His179)结合1个Zn2+[9]。Zn2+的结合被认为是p53核心结构域正确折叠所必需的，这种结合如果被破坏将会使p53DBD减弱甚至失去DNA结合和转录下游基因的功能[10]。核磁共振研究表明：在没有Zn2+的情况下，p53蛋白的DNA结合表面发生了结构变化;荧光各向异性研究表明：Zn2+的去除使p53DBD失去了位点特异性的DNA结合活性，但保留着非特异性的DNA结合活性[11]。另外，Cu2+结合p53蛋白，却导致p53构象和DNA结合活性的破坏[12]。然而，金属离子与p53DBD的结合平衡的研究尚未见报道。 　　细胞内存在多种金属离子，为了研究这些金属离子是否结合并影响p53DBD，本实验克隆并纯化了p53DBD蛋白，并在体外应用光谱法研究这些金属离子与p53DBD蛋白的结合反应，以及金属离子对蛋白结构及表面疏水性的影响。 2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　F4500荧光分光光度计(日本日立公司); Jasco J715分光偏振计(日本分光株式会社)。8苯胺1萘磺酸(ANS，Sigma公司);二硫苏糖醇(DTT，Merck公司);NaCl(天津市试剂六厂);蔗糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、TrisBase及咪唑均购于北京鼎国试剂公司;ZnCl2, MgCl2, CaCl2, FeCl3, MnCl2, CoCl2, CuCl2, BaCl2及NiCl2均购于天津大学科威公司。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。 　　高渗缓冲液A(20 mmol/L TrisHCl，2.5 mmol/L EDTA，200 g/L 蔗糖，pH 8.0);低渗缓冲液B(20 mmol/L TrisHCl，2.5 mmol/L EDTA，pH 8.0);缓冲液C(20 mmol/L TrisHCl，50 mmol/L NaCl，2 mmol/L CaCl2，pH 8.0);缓冲液D(0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L TrisHCl，5 mmol/L 咪唑，pH 8.0);缓冲液E(0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L TrisHCl，80 mmol/L 咪唑，pH 8.0);缓冲液F(0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L TrisHCl， 300 mmol/L 咪唑，pH 8.0);缓冲液G(50 mmol/L TrisHCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L DTT，pH 7.5)。 　 2.2 p53DBD的基因克隆、蛋白表达与纯化