黄芪注射液对慢性肾炎气虚血瘀证大鼠模型的药效学研究.docVIP

黄芪注射液对慢性肾炎气虚血瘀证大鼠模型的药效学研究 作者：杨倩春，杨霓芝，陈伯钧，雷娓娓，王桦，马红岩 【关键词】 黄芪 　　　　摘要：【目的】观察黄芪注射液对大鼠慢性肾炎气虚血瘀证模型的治疗作用。【方法】SD大鼠48只，除12只作空白对照组外，其他大鼠均在慢性肾炎模型的基础上加造气虚血瘀证模型后，随机分为模型组、黄芪高剂量组(8g/kg)和黄芪低剂量组(4g/kg)，每组12只；给药4周后，检测模型大鼠的一般状态、肾功能、细胞免疫功能及肾组织病理学改变，进行组间疗效比较。【结果】黄芪高、低剂量组对模型大鼠的一般状态、生化指标及肾组织的病理损害均有改善作用，并呈现出剂量效应关系。【结论】黄芪注射液能提高慢性肾炎气虚血瘀证大鼠的细胞免疫功能，改善血凝状态，减轻肾组织病理损害，有防治慢性肾炎的作用。 　　关键词：黄芪注射液/药理学；肾小球肾炎/中药疗法；肾小球肾炎/免疫学；肾小球肾炎/病理学；气虚血瘀；疾病模型，动物；大鼠 　　应用具有益气作用的黄芪注射液治疗慢性肾小球肾炎病人，临床已取得一定的疗效。在此基础上，我们观察了黄芪注射液对慢性肾炎气虚血瘀证模型的作用，现报告如下。 　　1 材料与方法 　　11 动物 　　健康低龄(3周)雄性SD大鼠(体质量约100g)4只，雄性新西兰兔8只，雄性SD大鼠48只(200～250g)，均由广州中医药大学实验动物中心提供。大鼠合格证号：2002A004；新西兰兔合格证号：2001A067。 　　12 试剂与仪器 　　兔抗鼠Thy1抗血清(AST)自备；完全弗氏佐剂由Sigma公司提供；抗兔IgG荧光抗体，由天象人公司提供；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗大鼠IgG由Sigma公司提供；亿鸣-200病理图像分析仪，由广州亿鸣科技有限公司提供。 　　13 药物 　　黄芪注射液每10mL含原生药20g，由成都地奥九泓制药厂生产，生产批号：0305061。 　　14 分组 　　雄性SD大鼠48只，随机分为4组，每组12只：模型组(A组)、黄芪高剂量组(B组)、黄芪低剂量组(C组)、空白对照组(D组)。 　　15 大鼠慢性肾炎模型的制备 　　抗Thy1系膜增殖性肾炎模型的建立参照文献［１］，步骤如下： 　　151 免疫New Zealand(NZ)白兔 　　低龄SD雄性大鼠4只，麻醉后取胸腺，剪碎并挤出胸腺细胞，经200目尼龙网过滤除去混杂的组织，滤液为淋巴细胞悬液，以等体积生理盐水和完全弗氏佐剂稀释至1×１０１０／Ｌ，注射至兔背部皮下，每只３×１０７个胸腺细胞；第2、4周时分别静脉注射３×１０７个胸腺细胞，强化免疫。 　　152 测定抗血清效价 　　第2次静脉注射胸腺细胞后第3天，从兔耳缘静脉取血2mL，测定血清抗胸腺细胞抗体的效价。方法如下：分离大鼠胸腺细胞，用生理盐水稀释至１×１０１１／Ｌ，取1滴细胞悬液滴于干净玻片，吹干，用体积分数为95%的酒精固定5min，吹干；将正常NZ白兔血清、抗血清原液及其1∶10、1∶20、1∶40、1∶80及1∶160的稀释液各80μL滴加在胸腺细胞涂片上，均匀散开；37℃孵育40min后用磷酸盐缓冲液(PBS)(001mol/L,pH74)冲洗；加抗兔荧光抗体(效价1∶10)，37℃孵育40min，PBS冲洗；当效价大于1∶80(即1∶80的稀释液仍有较强的染色)时将兔放血，离心后，将血清保存于-40℃。 　　153提纯血清 　　兔抗血清用饱和硫酸铵法提纯，抗血清(体积设为mL)中加入等体积的PBS(001mol/L,pH 74)及2倍体积的饱和硫酸铵溶液搅拌均匀，在4℃旋转30min后，以6000～9000r/min离心15min，去上清(为白蛋白部分)，沉淀溶于PBS中，再加入2mL饱和硫酸铵溶液，4℃旋转30min，6000～9000r/min离心15min，沉淀继续溶于PBS中，如上重复3次。最后将沉淀溶于少量PBS中，在4℃透析24h，用钠氏试剂检测无铵离子时即得粗制的抗体IgG，经测定蛋白浓度后，于-20℃保存。 　　154 大鼠抗Thy1抗体肾炎模型的制作 　　空白对照组尾静脉注射生理盐水20mL/kg；其余各组均于实验当日腹腔麻醉后由尾静脉注射AST 10mL/kg和正常兔血清10mL/kg。 　　16 大鼠气虚血瘀模型的建立 　　参考文献［２］方法，在实验第2周时，对各组大鼠行游泳疲劳试验，连续2周。