动物源性食品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定.docVIP

高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中硝基呋喃类代谢物残留量 郭德华1 汪国权2 王东辉1 李波1 王敏1 金玉娥2 陈笑梅3 （1. 上海出入境检验检疫局，上海 200135 2. 上海疾病预防控制中心， 上海 200336 3. 浙江出入境检验检疫局，杭州 310012） 摘要 依次用甲醇、乙醇和乙醚溶剂提取，使动物源性样品中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮、呋喃妥因等四种硝基呋喃类游离态代谢物进入提取液，而结合态代谢物保留在残渣中。在酸性条件下用2-硝基苯甲醛分别衍生游离态和结合态代谢物。经乙酸乙酯提取浓缩后，用液相色谱-四极杆串联质谱仪定性和同位素内标法定量。在0.3、1.0和5.0μg/kg3个浓度水平上进行添加回收试验，回收率为85.2~112.5%，检出限（LOQ）均为0.3μg/kg，相对标准偏差（RSD）均小于6.3%（n=6）。 关键词 硝基呋喃类代谢物 动物源性食品 液相色谱-四极杆串联质谱法 硝基呋喃类药物Nitrofurans主要是指:呋喃唑酮（furazolidone）、呋喃它酮（ furaltadone）、呋喃西林（nitrofurazone）(nitrofurantoin)等引入硝基的人工合成抗菌药，近年来发现其具有慢性毒性，可引起消化道反应，欧盟、美国等发达国家已禁止使用。硝基呋喃类药物在动物体内数小时内降解，但其代谢产物能与蛋白质紧密结合，形成稳定的残留，残留时间达数周之久，甚至在蒸煮、烘烤、磨碎和微波加热过程中也无法有效降解，因此检测硝基呋喃类药物的代谢产物，更能起到监控作用。目前欧盟对硝基呋喃类代谢物的检测方法灵敏度规定为1μg/kg[1]。 有关硝基呋喃类代谢物残留检测方法，主要有酶联免疫法[2]、液相色谱-紫外法[3]、液相色谱-质谱法[4]和液相色谱-串联质谱法[5]，由于酶联免疫法只能测定呋喃唑酮和呋喃它酮代谢物，液相色谱-紫外法、液相色谱-质谱法灵敏度较差，液相色谱-串联质谱法已成为此类代谢物检测的主要技术路线。我们采用两种前处理手段，分别提取游离态和结合态硝基呋喃代谢物，并使用相应的同位素作为内标，不仅具有分析不同状态硝基呋喃代谢物的优势，还可提高定量的准确性，满足对进出口动物源性食品中硝基呋喃类代谢物进行官方监控的要求。 1 实验部分 1.1 主要仪器与试剂 高效液相色谱仪：1100型，美国安捷伦公司； 四极杆串联质谱仪：API4000型，美国应用生物系统公司； 低温高速离心机、涡旋混合器、往复式恒温水浴摇床、均质器； 1.0 M盐酸； 甲醇、二甲基亚砜：HPLC级； 乙酸乙酯：分析纯； 50mM 2-硝基苯甲醛溶液：称取 75.5mg2-硝基苯甲醛并溶解于10ml二甲基亚砜中 (现用现配)； 0.1 M磷酸氢二钾溶液； 1.0 M氢氧化钠溶液； 去离子水； 硝基呋喃类代谢物混合标准溶液，分别称取10mg呋喃唑酮代谢物（AOZ）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃妥因代谢物（AHD）、呋喃西林代谢物（SEM）标准品（德国Witega公司提供），用甲醇配成100(g/mL的混合标准液； 硝基呋喃类代谢物同位素混合内标溶液，称取用氘、碳-13、氮-15标记的AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-D3、SEM-13C15N2标准品各10mg（德国Witega公司提供），用甲醇配成100(g/mL的混合标准液。根据检测需要用甲醇将混合标准液稀释成0.005μg/mL。 1.2 分析条件 1.2.1 液相色谱参数 流动相：甲醇+1.0 mM 醋酸铵水溶液（1+1）； 色谱柱：美国安捷伦公司Zorbax XDB-18 （150mm×2.1mm i.d.，5(m）； 流速：0.15ml/min； 柱温：室温； 进样量：30μL。 1.2.2 质谱参数 离子源：TurboIonSpray 电喷雾； 离子源喷雾电压：5500V； 离子源温度：540℃； 雾化气：42 L/min； 辅助气：45 L/min； 气帘气：25 L/min； 碰撞气：5 L/min； 检测模式：正离子多反应监测方法（MRM），参数条件见表1。 表1 多反应监测方法（MRM）参数 化合物 分子离子 碎片离子 驻留时间 (ms) 去簇电压 （V ） 入口电压 （V ） 碰撞电压 （V ） AOZ 236.2 104.1 134.2 40 40 66.0 66.0 32.0 18.3 32.0 18.3 AMOZ 335.2 291.3 262.3 40 40 66.0 66.0 17.7 25.0 17.7 25.0 AHD 249.2 104.1 134.1 150 150 66.0 66.0 32.0 18.0 25.0 32.0 SE