展示KDR胞外区VEGF结合域的T4噬菌体.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（１０）：１４２０ 展示ＫＤＲ胞外区ＶＥＧＦ结合域的Ｔ４噬菌体 对肺癌细胞增殖侵袭的抑制作用  李　 　何　琳　惠林萍　赵晨阳　于　涛 （中国医科大学附属四院 中心实验室　沈阳　１１００３２） 摘要　目的：构建展示ＫＤＲ的Ｔ４噬菌体并在细胞水平上检测其抑制肿瘤细胞增殖侵袭的作用及 机制。方法：利用ＳＯＥＰＣＲ的方法将ＫＤＲ膜外区Ｄ２和Ｄ３与Ｔ４噬菌体小衣壳蛋白ＳＯＣ基因融 合并克隆到ｐＥＴ２８ｂ表达载体中，经ＩＰＴＧ诱导表达并纯化后，利用体外展示技术将重组ＫＤＲＳＯＣ 蛋白展示在Ｔ４噬菌体表面，得到Ｔ４ＫＤＲ噬菌体。ＭＴＴ法检测Ｔ４ＫＤＲ噬菌体对肺癌Ａ５４９细胞 的增殖抑制作用，并采用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ法检测其对ＶＥＧＦ促侵袭作用的影响。ＲＴＰＣＲ法检测Ｔ４ ＫＤＲ对ＭＭＰ２和 ＭＭＰ９ｍＲＮＡ水平的影响，并通过 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法检测其对 ＶＥＧＦ诱导 ＥＲＫ１／２磷酸化及其下游ＣｙｃｌｉｎＤ１，ｐ２７，Ｂｃｌ２和 Ｂａｘ表达水平的影响。结果：ＫＤＲＳＯＣ在大肠 杆菌中稳定表达，展示ＫＤＲ的Ｔ４ＫＤＲ噬菌体具有结合ＶＥＧＦ１６５的能力，并显著抑制肿瘤细胞 增殖和侵袭活性，降低ＭＭＰ２和ＭＭＰ９基因ｍＲＮＡ水平。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明Ｔ４ＫＤＲ噬菌体 抑制ＶＥＧＦ诱导ＥＲＫ１／２的磷酸化，降低ＣｙｃｌｉｎＤ１及Ｂｃｌ２表达的同时，提高ｐ２７和Ｂａｘ的表达。 结论：展示ＫＤＲ的Ｔ４噬菌体具有抑制肺癌细胞增殖和侵袭作用，其对ＭＥＫ／ＥＲＫ信号通路及其 下游调控因子的影响是其作用的重要分子机制。 关键词　Ｔ４噬菌体　增殖　侵袭　血管内皮生长因子受体２　肺癌 中图分类号　Ｑ８１９ 　　Ｔ４噬菌体是目前已知的最大的细菌病毒之一，随 　　血管内皮生长因子受体２（ＶＥＧＦＲ２）或称激酶插 着对其研究的不断深入，以Ｔ４噬菌体展示技术为基础 入区受体（ｋｉｎａｓｅｉｎｓｅｒｔｄｏｍａｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＫＤＲ）是目前 建立起来的抗原或多肽展示平台，因技术操作简单，展 肿瘤抗血管靶向治疗以及抗肿瘤防治型疫苗开发的主 示外源蛋白／多肽拷贝数高等特点，已经成一种新兴的 要靶点之一，ＫＤＲ多肽或其ＤＮＡ疫苗在多种恶性肿瘤 ［１］ ［４５］ 药物疫苗载体 。Ｔ４噬菌体衣壳主要由ｇｐ２３、ｇｐ２４、 的体内外研究中均取得了较好的抗肿瘤效果 。根 ＳＯＣ和ＨＯＣ组成（图１ａ），其中ＳＯＣ在噬菌体衣壳装 据其结构和功能，ＫＤＲ分为胞内区、跨膜区及胞外区３ 配完成后才组装到衣壳表面，且其在噬菌体颗粒表面 个结构域，其胞外部分有 ７个免疫球蛋白样结构域 的拷贝数很高（８７０拷贝），故非常适合于噬菌体展示。 （Ｄ１Ｄ７），其中Ｄ２和Ｄ３已证实是与ＶＥＧＦ结合的主 ［６］ ［７］ 采用体内或体外展示技术将抗原蛋白或多肽与ＳＯＣ融 要结构域 。Ｒｅｎ等 将展示有完整 ＫＤＲ胞外区的 合并展示在噬菌体衣壳表面，能够在多种试验动物模 Ｔ４噬菌体颗粒免疫ＬＬＣ肺癌模型小鼠，实验动物能够 型中有效激发实验动物的细胞免疫和体液免疫应答并 产生ＫＤＲ特异性免疫应答抗体，同时也有效抑制肿瘤 ［２３］ 提供免疫保护 。 细胞的侵袭及增殖，但是这种 Ｔ４展示 ＫＤＲ的抗肿瘤 活性的机制及Ｔ４噬菌体展示 ＫＤＲ的生物学功能尚不 收稿日期：２０１３０７２９　　修回日期：２０１３０８２６ 明确。 国家自然科学基金、辽宁省教育厅科学技