入境环保微生物菌剂检测方法 第5部分：副溶血性弧菌 意见稿.docVIP

ICS点击此处添加ICS号 点击此处添加中国标准文献分类号 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T XXXXX—XXXX 进境环保微生物菌剂检测方法 第5部分：溶血性链球菌 Methods for examination of import microbe agentia for environment protection Part 5: Streptococcus hemolyticus 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准按照GB/T1.1—2009起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人本标准规定了入境环保微生物菌剂中溶血性链球菌的形态学鉴定、生化鉴定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于入境环保微生物菌剂中溶血性链球菌的检测和鉴定。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 对进行形态学生理生化PCR扩增或实时荧光PCR试验，GB19489中实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。 生理盐水：见附录A中A.1章。 葡萄糖肉浸液肉汤：见附录A中A.2章。 肉浸液肉汤：见附录A中A.3章。 血琼脂平板：见附录A中A.4章。 草酸钾人血浆：见附录A中A.5章。 0.25 %氯化钙：见附录A中A.6章。 杆菌肽药敏纸片（含0.04单位）。 TE缓冲液（pH值8.0）：见附录A中A.7章。 溶菌酶（10 mg/mL）: 见附录A中A.8章。 蛋白酶K（20 mg/mL）：见附录A中A.9章。 10 %SDS：见附录A中A.10章。 3 mol/L乙酸钠：见附录A中A.11章。 dNTP: dATP、 dTTP、 dGTP 、dCTP。 TBE：见附录A中A.12章。 Taq DNA 聚合酶。 细菌基因组DNA提取试剂盒。 琼脂糖。 溴化乙锭。 DNA分子量标记：100 bp DNA ladder。 主要仪器和设备 电子天平（感量0.01 g）。 拍击式均质器 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 恒温水浴锅。 台式冷冻离心机（最高转速15000 r/min）。 PCR扩增仪。 实时荧光PCR仪。 微量移液器和灭菌吸头：10 μL、20 μL、200 μL、1000 μL。 高压灭菌锅。 PCR超净工作台。 电泳仪。 核酸/蛋白分析仪。 凝胶成像系统。 无菌培养皿：直径90 mm。 以无菌操作取1 g（mL）样品加入到100 mL生理盐水中混匀，从中移取25 mL至盛有225 mL 灭菌生理盐水的无菌均质袋内，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。取样过程中，在样品旁边放置1个营养琼脂平板作为空白对照。 将上述样品匀液吸取5 mL，接种于50 mL葡萄糖肉浸液肉汤中，经36 ℃±1 ℃培养24 h。 无菌条件下，接种血平板，置36 ℃±1 ℃培养24 h，挑起乙型溶血圆形凸起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径约为0.5 mm-0.75 mm，为圆心突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有2 mm-4 mm界限分明、无色透明的溶血圈。 将7.3中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色，镜检。 溶血性链球菌呈球形或卵圆形，直径0.5 μm～1 μm，链状排列，链长短不一，短者4个-8个细胞组成，长者20 个-30 个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链，不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。 吸取草酸钾血浆0.2 mL，加0.8 mL灭菌生理盐水，混匀，在加入18 h-24 h、36 ℃±1 ℃培养的链球菌培养物0.5 mL及0.25 %氯化钙0.25 mL，震荡摇匀，置于36 ℃±1 ℃水浴中10 min，血浆混合物自行凝固，然后观察凝固块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24 h后不溶解即为阴性。 36 ℃±1 ℃培养18 h-24 h，如有抑菌带出现即为阳性，同时用已知阳性菌株作为对照。 结果报告 综合以上溶血性链球菌的形态学、生理生化试验的结果，报告1 g/(mL)样品中检出（或未检出）。DNA的提取 直接提取法 取7.3中菌液2 mL加到2 mL无菌离心管中，10000 r/m