家蚕微孢子虫病检疫技术规范.docVIP

前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本出入境检验检疫局出入境检验检疫局桑蚕微粒子病检疫技术规范 1 范围 本标准规定了桑蚕微粒子病的实验室诊断，包括聚合酶链式反应（PCR）法、实时荧光PCR法和光学相差显微镜检查法。 本标准适用于进出境家蚕（包括蚕种、幼虫、茧和蛾）微孢子虫的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文本的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 桑蚕 silkworm(Bombyx mori) 桑蚕为完全变态昆虫，具有卵、幼虫、茧和蛾（成虫）四个虫态。 3.2 蚕卵（蚕种） silkworm egg 蚕卵外观略呈扁平椭圆形，一端稍尖为前端，另一端稍钝为后端，膨起的一方为腹侧，与腹侧相对的一方为背侧。 蚕种是指用于养蚕生产和商业的蚕卵。 3.3 蚕幼虫 silkworm larva(larvae) 从卵孵化后的蚁蚕到化蛹期间的蚕，蚕幼虫呈长圆筒形，背方为圆形，分头部、胸部和腹部3个明显的体段。 蚕从吐丝器吐出丝物质后形成的，呈椭圆形和球形等形状，外为丝物质内存蚕蛹的蚕阶段。蚕茧分为干茧（）和鲜茧（）。前者是经过60℃～120℃干燥处理6小时，充分干燥的蚕茧，后者。（Nosema bombycis，简称Nb）3～4μm×1.5～2μm2 蛹体病征 出现大肚蛹，腹部环节松驰，环节上有大小不等的病斑，体表无光泽，反应迟钝。 4.3 蛾体病征 出现卷翅蛾，羽化后长期不展翅，或展翅不全；蛾体腹部有大小不等黑斑的黑星蛾；蛾体鳞毛脱落，呈焦黄色的秃蛾；蛾体腹部节间伸长松驰的大肚蛾，翅短小，病蛾交配能力差，产卵少，产附不整齐。 4.4 蚕卵病征 卵形不正，大小不均匀，排列不整齐，产重叠卵，易脱落，不受精卵、死卵多。 5 实验室诊断 5.1 聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光PCR方法 5.1.1 试剂与材料 5.1.1.1 试验所用试剂为分析纯，水应符合GB/T6682一级水要求。 5.1.1.2 蛋白酶K称取0.75克氯化钠，水溶解后100 mL。饱和酚氯仿异戊醇无水乙醇75%乙醇RNAase A:2mg/L。 5.1.1.10 3M 醋酸钠(pH5.2):称取40.8g NaAc.3H2O加水溶解后，加入冰乙酸调节pH值至5.2 ，加水定容至100 mL。 5.1.1.11 dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP,使用终浓度为0.2mmol/L。 5.1.1.12 Taq DNA聚合酶。 5.1.1.13 琼脂糖：用1×TAE溶液配制溴化乙锭含量为0.5μg/mL的1%-2%琼脂糖。 5.1.1.14 溴化乙锭：储存浓度10mg/mL，工作浓度为0.5μg/mL。 5.1.1.15 DNA marker：分子量标记100-2000bp。 5.1.1.16 核酸提取液mmol/L NaOH、50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.1% TritonX-100、0.05 mmol/L EDTA（pH 8.0）组成。高压灭菌，备用。 5.1.1.17 TE缓冲液（pH8.0）：量取10mL 1mol/L Tris-Cl(pH8.0)和2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0),加水定容至1000mL，1 高速台式冷冻离心机。 最大离心力12 000 g 以上。 5.1.2.2 4～8 ℃冰箱和-20 ℃冰箱。 5.1.2.3 微量加样器。 0.5 μL～10 μL，5 μL～20 μL，20 μL～200 μL，200 μL～1 000 μL。 5.1.2.4 PCR扩增仪。 5.1.2.5 电泳仪。 5.1.2.6 凝胶成像系统。 5.1.2.7 实时荧光定量PCR仪。 5.1.2.8 Precellys24（Bertin Technologies）多功能样本研磨均质器均质器425 μm - 600 μm的玻璃珠和陶瓷珠。 5.1.3 样品待检液加生理盐水，匀浆液用纱网过滤，收集滤液500r/min，离心 min，弃沉淀，上清液以5000 r/10min离心弃上清。用适量生理盐水悬浮，孢子液。取液，0.2mol/L KOH 0.5mL，充分混合27℃诱导1小时后5000 r/，离心5min，去。0.5mL生理盐水重悬，25℃放置30 min取液于破碎管中，加0.5 mL 、0.6 g混合珠（玻璃珠：陶瓷珠=3:1）和0.1 mL