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痘病毒载体的应用 翟新验*卢胜明 （北京实验动物研究中心北京100012） 摘要简单介绍痘病毒载体的实际应用。其原理是通过同源重组将外源DNA插入到痘病毒基因组的非实质区域，表达的外源蛋白能正确地进行修饰，并有较高的表达效率，可刺激机体产生免疫应答。痘病毒载体作为基因工程中的重要工具，其应用极其广泛，已成功地表达了来源于植物、动物，乃至人类的许多基因。 关键词痘病毒载体应用 收稿日期：20050405修回日期：20050913 * 电子信箱：zhaixy2002@痘病毒科是一大群、专性的病毒，直径300~400nm，脂质蛋白外壳，包绕着一个复杂的核心结构此结构含有一个线性近20kb双链DNA分子，编码多个亚单位，DNA依赖的RNA聚合酶，转录因子，帽结构和甲基化酶，多聚A聚合酶，都在病毒核心中包装，并转译成mRNAs。痘病毒在感染细胞的胞浆内增殖，这在DNA病毒是独有的。痘病毒中研究最多的是痘苗病毒。许多病毒的DNA分子具有感染性，将裸露的基因转染进细胞后能够进行复制，而痘病毒借助细胞酶并不能转录病毒基因组，因此，并不能产生病毒蛋白。其DNA则不具有传染性［1,2］。 痘病毒含有能够被真核细胞识别的启动子，这些启动子不但可以引发动物基因工程中常用的一些标记基因的表达，而且还能够引发克隆的外源基因的表达。痘病毒经过改建后，可以发展成为表达外源基因的分子载体。痘病毒早期基因的表达产物中，胸苷激酶是一种易于鉴定的标记，胸苷激酶编码基因是位于痘病毒基因组DNA的Ｈind IIIJ片段上。痘病毒正常功能的表达并不需要这个片段，当其被外源DNA取代之后，不会影响病毒基因组的复制。将编码胸苷激酶基因的痘病毒基因组的Ｈind IIIJ片段，克隆进质粒载体分子上，并在此非必需区中插入痘病毒启动子，在启动子下游连接欲表达的外源基因。接着对感染痘病毒1~2h的细胞，转染上述质粒，使重组质粒中所含的痘病毒非必需区序列，与痘病毒非必需区序列发生同源重组，外源基因在这一过程中重组到痘病毒基因组中，形成重组痘病毒粒子［3］。 1982年，研究人员将外源基因插入痘苗病毒的TK基因中，首次成功地构建了在哺乳动物细胞中表达外源基因的重组痘苗病毒［1］。近20多年来，应用重组痘病毒成功地表达了来源于植物，动物，乃至人类的许多种基因。被表达的外源蛋白，在感染细胞中，能忠实地进行修饰，与其它哺乳动物病毒表达载体相比，具有较高的表达效率；通过对动物接种重组痘病毒的方法，能了解外源蛋白对个体的作用以及机体的免疫应答；表达抗原基因的重组痘病毒，可作为基因重组疫苗。痘病毒作为基因重组活疫苗的载体，不需佐剂即可免疫动物，病毒在体内增殖过程中产生的外源蛋白可刺激机体产生免疫应答，不仅诱导机体产生体液免疫，而且诱导很强的细胞免疫［1］。 1痘苗病毒重组体和NYVAC痘苗病毒是原型痘病毒，感染多种细胞和实验动物，它是第一个痘病毒科中用于表达研究的病毒。痘苗病毒－狂犬病毒糖蛋白G重组体，是早期成功利用痘苗病毒载体的例证［4］ 。痘苗病毒作为表达载体具有下列几个特征：大分子基因组；重组病毒构建相对简单；细胞型的选择广泛；细胞浆内表达，减少了对核加工以及核RNA运输的特殊需要；依靠痘病毒基因组启动子，能有效地表达外源基因，并有很高的表达水平［3］。 利用痘苗病毒Copenhagen株构建的表达载体，将编码狂犬病毒糖蛋白的cDNA插入在此载体胸苷激酶座位中，破坏胸苷激酶座位，利用生物化学方法选择重组体。将此重组体作为活疫苗免疫动物，已获得了很好的效果［5］。另外有报道，痘苗病毒重组体指导氯霉素乙酰转移酶基因的表达［6］。NYVAC是痘苗病毒Copenhagen株致弱基础上发展的载体，从痘病毒基因组中精确地删除了与病毒毒力相关的基因，以及其它的与宿主复制竞争的、无用基因。NYVAC载体高度致弱的同时，保留了诱导保护性，在外源抗原免疫应答方式上，类似于亲代株胸苷激酶突变体［5］。NYVAC载体作为重组疫苗传递体系，已经在动物模型系统和目标品系包括人中应用，用NYVAC表达伪狂犬病毒糖蛋白，犬肌肉注射28d后，已经检测到中和抗体［7］。表达的马流感A1和A2血清型血凝素糖蛋白，接种马后，产生了血凝抑制抗体［5］。用NYVAC表达日本脑炎病毒prM/M,E和NS1多蛋白，接种猪，检测到了血凝抑制和中和抗体［8］。用NYVAC表达狂犬病毒糖蛋白基因，已在鼠、猫和犬体上，不仅表现出安全性，而且能够有效地保护动物，抵抗狂犬病毒的攻击。用NYVAC表达疟原虫，免疫鼠，诱导了结合抗体和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）作用［9］。 早期痘苗病毒转录中，缺少裂解酶，作为表达一些真核细胞的载体时，受到一定的限制，然而，此问题已通过将cDNA插入进痘苗病毒基因组中而得到解决［4］。目前尽管只有几千bp的基因序