实验四SDS－PAGE测定蛋白质的相对分子量.pptVIP

实验一 SDS－PAGE测定蛋白质的相对分子量 【基本原理】 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。 这种迁移率的不同，就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和形状有关。 当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS）时，则得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可推测蛋白质的分子量。 SDS的作用原理SDS是一种阴离子去污剂，能够与蛋白质结合，破坏蛋白质分之间以及与其它物质分子之间的非共价键,使蛋白质变性而改变原有的空间构象。 蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷符号的差异。 并且由于分子量越大的蛋白质结合的SDS越多，所带负电荷也越多，这就使各蛋白质-SDS复合物的电荷密度趋于一致。 同时，不同蛋白质的SDS复合物形状也相似，均是长椭圆状。 因此，在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷量无关。 当SDS的总量为蛋白量的3～10倍且SDS单位浓度大于1mol./L时，这两者的结合是定量的，大约每克蛋白质可结合1.4克SDS。 【器材]电泳仪、垂直板电泳槽、进样器、乳头吸管、50ml小烧杯 【试剂】1．标准蛋白质： 2．30%丙烯酰胺溶液： 丙烯酰胺29.2g， 甲叉双丙烯酰胺0.8g， 加水至100ml，棕色瓶4℃保存。 3．1.5mol /L Tris-Hcl分离胶缓冲液  pH8.8（4x）： 取18.15g Tris， 用1MHCl调pH 至 8.8，加水至100ml，4℃保存4．0.5 mol /L Tris-HCl浓缩胶缓冲 液，pH6.8（4x）： 取5.98g Tris，用1N HCl调至pH 6.8，加水至100ml，4℃保存。 5．电极缓冲液（pH8.3）：  取 14.49g甘氨酸，3.02g Tris，加 100ml 10%SDS，加水至1 升，4℃ 保存。6．10% SDS： 取10g SDS，加水至100ml， 完全溶解后室温保存。7．10%过硫酸铵溶液（AP）： 临用前现配。 8．染色液（0.25%考马斯亮蓝 R-250、50%甲醇、7%乙酸）： 考马斯亮蓝R-250 2.5g、 甲醇（可用无水乙醇代替） 500ml、70ml冰乙酸， 溶解后补足水至总体积1000ml。9．脱色液（30%甲醇、7%乙酸）： 甲醇（可用无水乙醇代替） 300ml，冰乙酸70ml， 补足水至1000ml。 10．样品缓冲液（2x）：  H2O 2.4ml，浓缩胶缓冲液1.0ml、甘油0.8ml、10% SDS 3.2ml，2-硫基乙醇0.4ml，0.025%（W/V）溴酚兰0.2ml。11．TEMED（四甲基乙二胺） 操作步骤1．安装制胶模具A 、要用琼脂进行封边，防止  凝胶泄露，尤其注意边角的 地方。B、安装时，要将螺丝拧紧， 也是为了防止泄露。 2．根据所测蛋白质的相对分子量范围，选择某一合适的分离胶浓度。按下表所列的试剂用量配。 分离胶的配制 将分离胶混匀后立即灌注于玻板间隙中，上层小心覆盖一层正丁醇。将胶板垂直放于室温下，待分离胶聚合完全后，倾去正丁醇并用滤纸吸干。 灌胶时要注意： 催化剂不能加多了，加完催化剂要充分混匀，且立即灌胶， 灌胶时要保持小烧杯摇动，防止烧杯内的胶聚合。 灌胶动作要快，吸一满管的凝胶后，立即沿胶板的一角灌入，而且要防止气泡的产生。 3．浓缩胶的制备按下表配制浓缩胶，将浓缩胶混匀后直接灌注在已聚合的分离胶上，立即插入梳子，将凝胶垂直放于室温下聚合。  浓缩胶的配制 4．样品预处理： 取样品液与等体积样品缓冲液 混合，100℃加热1～2分钟。5．待浓缩胶聚合完全后，小心移出 梳子，然后将胶板固定于电泳装置 上，上下槽各加入电极缓冲液。6．加样： 用微量进样器加样。 每个样品孔加入20ul样品。 同时加一个标准品。 7．电泳： 在30mA的电流压下电泳，当样品全部进入分离胶时，加大电流至60mA，当溴酚蓝达到胶底部，关闭电源。 8．染色：