NY_T 908-2004 羊干酪样淋巴结炎诊断技术.docVIP

羊肝酪样淋巴结炎诊断技术 Diagnotic technique for caseous lymphadenitis in sheep and goat 2005-01-04 发布 2005-02-01 实施前 言 本标准的附录A、附录B为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：西北农林科技大学。 本标准主要起草人：张彦明、邢福珊。 羊干酪样淋巴结炎诊断技术 1 范围 本标准规定了羊干酪样淋巴结炎(caseous lymphadenitis in sheep and goat，简称CLA)病原菌分离与鉴定和酶联免疫吸附试验2种检疫方法。 本标准规定的病原菌分离与鉴定适用于羊干酪样淋巴结炎的诊断，酶联免疫吸附试验适用于羊干酪样淋巴结炎的诊断、检疫及流行病学调查。 2 病原菌分离与鉴定 2．1 发病羊的淋巴结肿大，呈脓性干酪性坏死，病羊消瘦，生产性能下降，孕羊产出死胎，严重者死亡。在发病羊的肺、肝、脾和子宫角发生大小不等的结节，内含淡黄色于酪样物质。 2．2 鲜血琼脂，血清琼脂，葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、淀粉、蕈糖发酵培养基，含0.2％吐温-80的马丁肉汤，成分和制备方法见附录A。 2．3 按无菌操作方法用18号以上的针头和注射器采取淋巴结中干酪样脓汁，作为病原菌分离与鉴定的病料。 2．42．4．137℃培养24 h，观察菌落生长情况。 2．4．2 2．4．3 2．4．4 2．5 将可疑菌落纯培养后，接种于2．2中的各种糖发酵培养基试管中，37℃培养24 h，若葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖发酵产酸不产气，而淀粉、蕈糖不发酵，则判定为伪结核棒状杆菌。 3 酶联免疫吸附试验(ELISA) 3．1 见附录B．1。 3．2 见附录B．2～B．6。 3．3 3．3．1 购买酶标兔抗羊IgG，用时以稀释缓冲液作1：4 000稀释。 3．3．2 3．3．2．1 用无菌操作法从羊的颈静脉采取5 mL血液于洁净的灭菌小瓶内，盖上瓶塞，倾斜静置，待析出血清后，用灭菌巴氏管将血清吸至另一洁净的灭菌小瓶内，置-20℃冰箱保存，保存期6个月，用时融解并作1：40稀释。 3．3．2．2 将临床上健康、伪结核棒状杆菌菌体凝集抑制试验检测结果为阴性的临产前山羊当作未受伪结核棒状杆菌感染的羊只，剖腹产后，采其胎羔心脏血液分离的血清作为阴性血清。 3．3．2．3 将伪结核棒状杆菌参考菌株(ATCC 19410株)人工感染羊，感染羊临床上出现症状，30 d后，从肿大的淋巴结中可分离到与感染菌相同的病原菌，采其血液分离的血清作为阳性血清。 3．3．2．4 从随机抽样的待检羊所采血液分离的血清作为待检血清。 3．43．4．150μL／孔（设立2孔空白对照，不加抗原)，在4℃冰箱中过夜。 3．4．2 (本方法中用稀释缓冲液作为洗涤液)200μL，甩出孔内液体，反复5次，最后一次甩出孔内液体后在吸水纸上将孔内水分拍干。 3．4．3 加了抗原的孔加1％BSA 50μL／孔(封闭)，置37℃温箱1 h。洗涤酶标板(方法同3．4．2)。 3．4．4 50μL／孔(2孔阳性血清和2孔阴性血清作对照，其他孔加待检血清各2孔)，置37℃温箱1 h。洗涤酶标板(方法同3．4．2)。 3．4．5 IgG50μL／空，置37℃温箱1 h。洗涤酶标板(方法同3．4．2)。 3．4．650μL／孔，置37℃温箱显色15min，取出，每孔加终止液50μL，混匀后用酶标仪测OD492值。 3．5 用P／N值进行判定。P(P0sitive)即阳性血清或待检血清平均OD值，N(Negative)即阴性血清平均OD值。若P刷2，则判为阳性；若P刷≤2，则判为阴性。阳性对照孔P刷值必须大于2，否则试验无效。 附录A (规范性附录) 病原菌分离与鉴定培养基的成分和制备方法 A．1 A．1．1 普通琼脂 100mL 无菌抗凝血或脱纤血 5mL A．1．2 A．1．2．1 (5.0 g／L柠檬酸钠：血液=1：9或0.1 g／L肝素：血液=1：99)，按常规方法制成脱纤血或抗凝血。 A．1．2．250℃左右，按5％～10％的量加入血液，混匀后分装于容器(平皿、试管等)，制成血液琼脂培养基，无菌检验合格后使用。 A．2 将血液琼脂中的血液成分换作血清即制成血清琼脂。 A．3 A．3．1 猪胃消化液 牛肉浸液 葡萄糖 吐温一80