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临床医学论文-增强型绿色荧光蛋白基因转染CHO细胞研究
??????????????? 作者： 郑立恒 魏会平 许松梅 孙伟华 李保国 胡火珍 刘全胜
【摘要】目的：探讨增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP)在中华仓鼠卵巢细胞（CHODHFR）细胞中的作用。方法：将增强型绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA31(+)EGFP, 转染至培养的中华仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary, CHODHFR-）中。结果：成功表达并产生绿色荧光。结论：证明EGFP是一种良好的报告基因和筛选标志，为进一步研究应用最广泛的哺乳动物细胞表达系统―CHO细胞表达系统奠定了基础。
??? 【关键词】增强型绿色荧光蛋白；转染；中华仓鼠卵巢细胞
eukaryotic expression vector pcDNA31 (+) in enhanced green fluorescent protein,EGFP was transfected into Chinese Hamster Ovary (CHO) cells.CHO cells transfected by EGFP were selected by G418 and then monitored under microscope for observation of the emission of green fluorescence.Results:The results showed that the CHO cells transfected by EGFP expressed green fluorescent protein successfully.Conclusion: Implying that EGFP was a good reported and seleted marker molecule in mammalian cells.This laid the foundation for investigation of CHO cells system which is the most popular mammalian cells expression system.
??? 【KEY WORDS】Enhanced green fluorescent protein;Transfect;CHODHFR
??? 近年来，科学研究者们对从维多利亚水母中克隆得到的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）这一报告的标记基因产生了浓厚的兴趣[1]，荧光显微可以监视GFP的表达情况，表达时不需要加入抗体、辅因子、酶底物等其他成分，不影响宿主细胞。GFP是一种稳定蛋白，即使在比较高浓度的强毒性药剂（如HCI胍、尿素、硫酸盐等）中延长孵育时间荧光仍可持续存在[2]。因此GFP可以鉴定、跟踪、分选表达GFP的细胞，GFP已成为细胞生物学和分子生物学中广泛应用的报告蛋白[3]。CHO DHFR-细胞由于已成功表达了多种重组蛋白而成为公认的工业化生产活性蛋白的重要工具。EGFP基因是在GFP基因基础上改造而来的一种GFP基因的突变体，具有在动物细胞中表达较强荧光的特点。本研究旨在探讨EGFP在CHODHFR细胞中的表达情况。
??? 1材料和方法
??? 11材料
??? pcDNA31(+)EGFP质粒，宿主菌BL21由本实验室提供，CHODHFR购自ATCC公司，G418购自GIBCO BRL公司，胎牛血清、质粒回收试剂盒购自SIGMA公司，脂质体购自Roche公司，alphMEM（+）培养基购自Ivitrogen公司，胶回收试剂盒购自博大泰克生物公司。
??? 12方法
??? 121转化和质粒鉴定将pcDNA31(+)EGFP质粒转化宿主大肠杆菌BL21，在长波紫外灯下筛选鉴定所需的发出绿色荧光的克隆，得到含所需质粒的菌落，进行测序鉴定。
??? 122质粒的大量制备和纯化100ml的三角烧瓶内加入含氨苄青霉素（01×10-3 g/ml）的LB培养基30ml,含pcDNA31(+)EGFP质粒的细菌培养物1ml,37℃剧烈摇菌过夜，用试剂盒提取和纯化质粒。
??? 123细胞培养37℃水浴复苏冻存的 CHODHFR细胞，用含10%胎牛血清和双抗的alphMEM（+）培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，3d后传代，当细胞稳定生长后传入25mm培养盘中，当细胞生长至50%~80%融合后进行转染。
??? 124基因转染按脂质体转染试剂盒说明书进行操作，实验中设未转染的细胞作为对照。
??? 125阳性克隆的筛选和荧光显微镜观察细胞转染24h后换筛选
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