纤维素酶高产菌的筛选鉴定及纤维素酶基因的克隆与表达.pdfVIP

中国农业大学学报 2012，17(5)：92—98 JournalofChinaAgriculturalUniversity 纤维素酶高产菌的筛选鉴定及纤维素酶基因的克隆与表达 刘海艳 白龙 赵海波 杨 明明 曹斌云 (西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100) 摘 要 为寻找新纤维素酶和纤维素酶基 因资源 ，以羧 甲基纤维素钠 (CMC)改 良的BHM培养基筛选菌株 ，经初 筛和复筛筛选 出 目的菌株后 ，采用革兰氏染色法和 16SrDNA基 因片段 比时法对筛选 出的菌株进行鉴定 ；设计 引 物对P扩增其纤维素酶基 因，连于 pET一28a(+)栽体构建原核表达栽体并转入大肠杆菌 BL21(DE3)进行表达 ，表 达结果采用 SDS和测定表达产物活性的方法来检验 。结果显示 ，本研究成功筛选 出一株新的具有较高纤维 素酶活的短小芽孢杆菌 BY一1，该菌所产纤维素酶具有较好的热稳定性和酸碱稳定性 ，最适宜温度和 pH分别为 55 ℃和 7．45，在此条件 下最高酶活性为0．9216 mol／(mL ·min)；此外 ，还成功克隆出1个 1851bp的纤维素酶新 基 因bglC—BY，具有 GH9／CBM3纤维素酶结构 ，经 IPTG诱导，SDS图谱上于 70ku有 1个明显 的蛋 白条 带，表达产物酶活性为 0．5413 mol／(mL ·rain)。本研 究筛选 出的短小芽孢杆菌 内切纤维素酶活较高，具有一定 的应用前 景。 关键词 纤维分解茵；筛选 ；纤维素酶基 因；克隆；表达 中图分类号 S852．612 文章编号 1007—4333(2012)05—0092—07 文献标志码 A Cloningandexpressionofanovelcellulasegene frOm ansolatedBacilluspumilusstrain LIU Hai—yan，BAILong，ZHAO Hai—bo，YANG Ming—ming，CAO Bin—yun (CollegeofAnimalScienceandTechnology，NorthwestA＆FUniversity，Yangling712100，China) Abstract The aim ofthisstudywasto exploitnew resourcesofcellulolyticbacteria and new celIuiose genesfor industrialprocesses．inthisstudy，targetedbacteriawere screenedbyCMC amendedBHM medium and identifiedby Gram stainingwith16S rDNA partialsequencealignment．Afteramplificationofcellulasegeneusing primerpairP，it wasligated to pET一28a(+ ) in corresponding sites to constructprokaryotic expression vector．HeterOgene0us expressionwasconductedinE．colfBL21(DE3)andverifiedbySDS—PAGEandenzymedetection．TheBacilluspumilus BY一1withpremium enzymeactivitywassuccessfullyscreened．Undertheoptimum conditionof55 ℃ intemperature and7．45inpH，thecrudeenzyme，reachedthemaximumenzymeactivityat0．9216p．mol／(mL ·min)．Simultaneously， anew 1851bpcellulasegenebglC-BYwiththestructureofGH9／CBM3wassuccessfullyclonedfro