ONOAE248诱发中性粒细胞非凋亡性程序化死亡的蛋白质组学研究.pdf

ONO-AEl248诱发中性粒细胞非凋亡性程序化死亡的 蛋白质组学研究 摘 要 目的：在建立蛋白质组分析方法的基础上，运用质谱技术并结合 生物信息学方法，对前列腺素E2受体EP3的选择性激动剂 celldeath)和正 programmed 非凋亡性程序化细胞死亡(non·apoptotic 常中性粒细胞自发性凋亡进行蛋白质组学研究，分析鉴定在这两种不 同的生物学过程中的差异表达蛋白质，并动态观察这些差异蛋白质在 PMN非凋亡性程序化细胞死亡过程中表达的动力学特征，以期为探 讨“非凋亡性程序化死亡”这种新的细胞死亡方式的分子机制提供实 验依据，为丰富细胞死亡的多样性奠定理论基础，同时也为重新认识 和定位中性粒细胞在固有性免疫应答中的地位和作用提供新的思路。 方法：采用梯度离心法分离、纯化正常人外周血中性粒细胞，调整细 胞数为2x106／ml，以每孔1ral接种于24孔培养板中。将分离的PMN 随机分为实验组和对照组，在实验组中每孔均加入ONO．AE．248(终 h、24 h，构建PMN非凋亡性程序化死亡和自发性凋亡的细胞模型。 在各时间点分别提取实验组和对照组PMN的全细胞蛋白质，Bradford 法测定蛋白质含量，双向电泳(一向采用pH4．7的固相pH梯度(IPG) 等电聚焦，二向采用浓度为10％的十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS．PAGE)分离蛋白，银染后获得双向电泳图谱。凝胶成像 系统采集电泳图谱，根据IPG胶条的线性梯度和标准分子量marker 1 和对照组PMN的蛋白质电泳图谱进行差异分析，并初步筛选出培养 12 h时实验组和对照组中的20个具有显著差异的蛋白质斑点。切下 筛选出的20个蛋白质点，运用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱技 术(MAID1．TOF-MS)进行检测，获得各蛋白质的肽指纹图谱和荷 查询，初步鉴定培养12 h时，PMN非凋亡性程序化细胞死亡和自发 性凋亡的差异表达蛋白质，并利用PDQuest2．DE软件对其中两种重 要的差异蛋白质表达的时间动力学进行分析。结果：1．双向电泳结 果显示，ONO-AE．248诱发的PMN非凋亡性程序化死亡在培养的不 h、6h、12h、24 同时间(2 h)蛋白质表达图谱存在明显差异。2． 过程中蛋白质表达存在显著差异。3．利用质谱技术和生物信息学鉴 定，确定了12个PMN非凋亡性程序化死亡与自发性凋亡的差异表 3533)(4)， macrophage 白转运蛋白、B．内酰胺酶样前体；仅在自发性凋亡的PMN中表达的 ， 是：氧化还原酶、ATP结合蛋白、B2N18．040、转录因子4复合体、 铁氧化还原蛋白；两组均有表达但表达量不同的是：组胺酸磷脂酶(实 验组蛋白表达比对照组低800％)、阳离子流出蛋白(实验组蛋白表达 比对照组高96％)、骨髓巨噬细胞cDNA编码蛋白(实验组蛋白表达 比对照组低31％)、ASC(实验组蛋白表达比对照组低85％)。5．对 蛋白(ASC)的表达进行时间动力学分析发现，两种蛋白质的动力学 曲线在对照组均呈峰形，于12h表达达到最大值后逐渐下降：而在 h至12h呈现持续低表达，于12h表 实验组DVU_2490的表达于2 达即快速下降，至24h已检测不到该蛋白的表达；ASC在实验组的 表达也呈现较低水平，在6h即达高峰，随后表达逐渐下降，24h时 仅检测到微量表达。结论： 1．ONO-AE．248诱发的中性粒细胞非凋 亡性程序化死亡随时间变化伴随有蛋白质组的明显改变。2． 发性凋亡的蛋白质组存在显著差异，提示两种死亡方式发生的分子机 制有较大差异。3．ONO．AE．248诱导人PMN产生非凋亡性程序化细 胞死亡的机制可能涉及到多种转录因子、催化代谢的酶类和细胞骨架 胞死亡